人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定.pdf

1、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是機(jī)體免疫系統(tǒng)非常重要的一類抗原提呈細(xì)胞，是目前已知的抗原提呈功能最強(qiáng)的專職APC，可啟動(dòng)并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，刺激T、B淋巴細(xì)胞活化，在抗腫瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病發(fā)病過(guò)程中起重要作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)DC還具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受的作用。 目的：在體外建立起一個(gè)穩(wěn)定的從人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)未成熟及成熟DC的培養(yǎng)體系，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況，并應(yīng)用MTT法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的功能進(jìn)行

2、測(cè)定，從而確保獲得具有一定形態(tài)和功能特征的DC，為進(jìn)一步探討DC在免疫耐受及抗腫瘤方面作用奠定基礎(chǔ)。 方法：采用塑料貼壁法從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞獲取單核細(xì)胞，第一階段在GM-CSF+IL-4因子組合聯(lián)合誘導(dǎo)下培養(yǎng)細(xì)胞5～7天，獲得未成熟DC；第二階段在GM-CSF+TNF-α因子組合聯(lián)合誘導(dǎo)下培養(yǎng)細(xì)胞至12～14天，獲得成熟的DC。對(duì)DC的形態(tài)進(jìn)行觀察，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD14、CD83、CD1a、CD80、CD86、H

3、LA-DR、CD25分子的表達(dá)，采用吞噬中性紅的方法檢測(cè)未成熟DC的吞噬功能，再次混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察未成熟DC處理過(guò)的T細(xì)胞對(duì)與未成熟DC同一供者來(lái)源的T細(xì)胞的應(yīng)答能力，測(cè)定DC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)異種T細(xì)胞的刺激作用，以及DC抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。 結(jié)果：用GM-CSF+IL-4 細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時(shí)后出現(xiàn)呈半懸浮狀態(tài)的細(xì)胞，但未見(jiàn)細(xì)胞表面有明顯的突起，培養(yǎng)4～6天出現(xiàn)成簇現(xiàn)象，散在分布在培養(yǎng)板中；加入TN

4、F-α誘導(dǎo)后，成簇現(xiàn)象明顯增多，呈現(xiàn)以樹(shù)枝狀不規(guī)則變化的貼壁細(xì)胞為底的圓形細(xì)胞集落，可以見(jiàn)到圓形、帶有毛刺狀突起的懸浮細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，成簇的細(xì)胞團(tuán)散開(kāi)，形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞減少，培養(yǎng)12天即可以看到多數(shù)細(xì)胞表面有明顯的毛刺狀突起， 14天時(shí)幾乎均為單個(gè)具有典型DC形態(tài)的懸浮細(xì)胞。未成熟DC中度表達(dá)CD1a、CD80、CD86、CD25分子，高表達(dá)HLA-DR分子，低表達(dá)CD83分子；成熟期中度表達(dá)CD1a分子，CD80、CD86、CD

5、25、HLA-DR及CD83分子均高表達(dá)；在DC的未成熟期與成熟期均中度以上表達(dá)CD14分子；DC隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同內(nèi)吞能力在培養(yǎng)7天時(shí)達(dá)高峰，且內(nèi)吞能力強(qiáng)于相同培養(yǎng)時(shí)間的單核細(xì)胞（p＜0.05）；在再次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，供者未成熟DC預(yù)處理的受者T細(xì)胞當(dāng)再次被供者的T細(xì)胞刺激時(shí)應(yīng)答降低，而對(duì)第三者的T細(xì)胞刺激則表現(xiàn)強(qiáng)的反應(yīng)性。中度表達(dá)共刺激分子的未成熟DC在體外可以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫低應(yīng)答。刺激同種異型T淋巴細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)。具有抑制腫