Tim-3表達(dá)調(diào)控慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞功能的研究.pdf

1、目的：通過研究Tim-3對(duì)單核細(xì)胞功能的調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制，為減輕肝臟炎癥和逆轉(zhuǎn)病情進(jìn)展提供免疫治療新靶點(diǎn)。
　　方法：1.Tim-3在慢乙肝患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)
　　1.1收集慢乙肝患者(CHB)和健康對(duì)照者(HC)新鮮外周肝素抗凝血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMCs中CD14+細(xì)胞(單核細(xì)胞)表面Tim-3的表達(dá)。
　　1.2收集慢乙肝患者(CHB)和健康對(duì)照者(HC)新鮮外周肝素抗凝血，通過

2、密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，在塑料平皿中貼壁2h后獲取單核細(xì)胞(Mo)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Tim-3 mRNA在不同分組Mo中的表達(dá)。
　　1.3 CHB患者外周血單核細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)與外周血清炎癥水平及病毒指標(biāo)等進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.Tim-3通路對(duì)LPS誘導(dǎo)CHB患者外周血單核細(xì)胞生成炎癥因子功能的影響
　　2.1通過密度梯度離心法和貼壁法獲取CHB患者外周血Mo，實(shí)驗(yàn)分為L

3、PS+Galectin-9組、LPS組和空白組。調(diào)整LPS終濃度為1μ g/ml，重組人Galectin-9活性蛋白終濃度為5μg/ml，LPS預(yù)先刺激6h后加入重組人Galectin-9活性蛋白共刺激48h。
　　2.2 ELISA法檢測(cè)各組上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。
　　2.3細(xì)胞內(nèi)因子染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組單核細(xì)胞中TNF-α+細(xì)胞頻數(shù)和IL-6+細(xì)胞頻數(shù)。
　　2.4熒光實(shí)時(shí)定量P

4、CR法檢測(cè)各組單核細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平。
　　3.Tim-3通路對(duì)CHB患者單核細(xì)胞誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的影響
　　3.1密度梯度離心法聯(lián)合貼壁法分離CHB患者外周血單核細(xì)胞(Mo)與免疫磁珠分選法分離健康人外周血初始CD4+T細(xì)胞(Th0)混合培養(yǎng)6d，實(shí)驗(yàn)分為單核細(xì)胞+Tim-3阻斷抗體組、單核細(xì)胞+丙種球蛋白組、單核細(xì)胞組和無單核細(xì)胞組四組。
　　3.2用ELJSA法分別檢測(cè)上

5、述各實(shí)驗(yàn)分組中細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-17含量。
　　3.3細(xì)胞內(nèi)因子染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)上述各實(shí)驗(yàn)分組中Th17細(xì)胞頻數(shù)。
　　3.4半定量PCR法分別檢測(cè)上述各實(shí)驗(yàn)分組中IL-17AmRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.Tim-3在CHB患者外周血單核細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
　　1.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CHB組外周血CD14+Tim-3+細(xì)胞頻數(shù)顯著高于HC組(X2=144.40，P<0.01)。
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6、.2熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CHB組單核細(xì)胞中Tim-3 mRNA的表達(dá)顯著高于HC組(t=1.84，P=0.040)。
　　1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CHB組中CDl4+Tim-3+％與外周血清ALT水平成正相關(guān)(r=0.362，P=0.028)，而與HBV DNA滴度、HbeAg狀態(tài)無明顯相關(guān)性。
　　2.Tim-3通路可促進(jìn)LPS刺激單核細(xì)胞生成炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)
　　2.1 T

7、im-3通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)CHB外周血單核細(xì)胞生成TNF-α統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ELISA結(jié)果示LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度顯著高于空白組(P=0.036)，LPs+Galectin-9組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度顯著高于LPS組和空白組(P=0.037，P=0.003)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用2-△△Ct比較法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中單核細(xì)胞TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果示LPS+Galectin-9組中TNF-α mRN

8、A的表達(dá)量顯著高于LPS組和空白組(P=0.044，P=0.037)，且LPS組TNF-α mRNA表達(dá)量也顯著高于空白組(P=0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LPS+Galectin-9組CD14+TNF-α細(xì)胞頻數(shù)顯著高于空白組(P=0.004)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與LPS組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.563)。
　　2.2 Tim-3通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)CHB外周血單核細(xì)胞分泌IL-1β2-△△Ct比

9、較法結(jié)果顯示LPS+Galectin-9組IL-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于LPS組和空白組(P=0.026，P=0.014)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA結(jié)果類似。
　　2.3 Tim-3通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)CHB外周血單核細(xì)胞分泌IL-6 ELISA法檢測(cè)上清液中IL-6含量，結(jié)果示LPS及Galectin-9共刺激時(shí)IL-6水平明顯高于LPS組和空白組(P=0.014，P=0.000)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光實(shí)時(shí)定量

10、PCR檢測(cè)IL-6 mRNA表達(dá)量，2-△△Ct比較法結(jié)果類似：LPS+Galectin-9組顯著高于LPS組和空白組(P=0.035，P=0.028)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LPS+Galectin-9組和LPS組CD14+IL-6+細(xì)胞頻數(shù)均顯著高于空白組(P=0.033，P=0.019)，而CD14+IL-6+細(xì)胞頻數(shù)在LPS+Galectin-9組和LPS組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.894)。
　　3.阻斷單核細(xì)胞Tim

11、-3通路可下調(diào)其對(duì)Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用
　　3.1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中Th17細(xì)胞頻數(shù)本實(shí)驗(yàn)認(rèn)定CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞為Th17細(xì)胞。無Mo組中Th17細(xì)胞頻數(shù)顯著低于Mo組和Mo+丙球組(P=0.002，P=0.004)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mo+Tim-3阻斷抗體組中Th17細(xì)胞頻數(shù)顯著低于Mo組和Mo+丙球組(P=0.009，P=0.020)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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12、.2半定量PCR法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中IL-17 mRNA的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果使用BandScan軟件進(jìn)行半定量分析，IL-17與β-actin的灰度值進(jìn)行對(duì)比獲得IL-17電泳條帶的相對(duì)灰度值。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：Mo+Tim-3阻斷抗體組中IL-17mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于Mo組和Mo+丙球組(P均<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。無Mo組中IL-17mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于Mo組和Mo+丙球組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

13、
　　3.3 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17含量結(jié)果顯示無Mo組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度顯著低于Mo組、Mo+丙球組和Mo+Tim-3阻斷抗體組(P=0.019，P=0.005，P=0.004)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Mo+Tim-3阻斷抗體組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度低于Mo組和Mo+丙球組(P=0.049，P=0.014)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：1.CHB患者外周血單核細(xì)胞表面Tim-3分子表