骨橋蛋白在人妊娠早期母胎界面的表達(dá)及生物學(xué)意義的研究.pdf

1、前言 人類妊娠過程中，胚胎植入蛻膜化的子宮黏膜壁并形成胎盤。來自胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲入子宮粘膜，并打通子宮動脈從而保障胎兒發(fā)育中豐富的血運。植入期的子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)抵抗半異基因胚泡的界面，細(xì)胞群體發(fā)生變化并保持協(xié)調(diào)的相互作用。細(xì)胞相互作用的另一結(jié)果是子宮內(nèi)膜為植入準(zhǔn)備而分化，其重要的變化之一是在蛻膜化的過程中，通常發(fā)生子宮NK細(xì)胞(uterinenaturekiller，uNK)的浸潤，發(fā)生妊娠時其數(shù)目繼續(xù)增加并與滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系

2、。目前植入免疫學(xué)(implantationimmunology)研究的熱點均聚焦于uNK細(xì)胞。從胚泡植入子宮起，子宮內(nèi)膜的淋巴細(xì)胞即重新組合，蛻膜細(xì)胞中聚集了大量的淋巴細(xì)胞約占40％以上，其中uNK細(xì)胞占了早期妊娠蛻膜中內(nèi)膜淋巴細(xì)胞的70％以上[1]。雖然，到目前為止uNK細(xì)胞在妊娠中的確切作用仍然是個謎，但對胚胎植入?yún)^(qū)的研究發(fā)現(xiàn)有大量的uNK細(xì)胞并與入侵的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞形成緊密接觸，提示uNK細(xì)胞在調(diào)控母體對半異基因胚泡的容受性中起重

3、要的作用。uNK細(xì)胞缺陷小鼠胚胎丟失率高達(dá)64％、且無子宮內(nèi)膜腺、胎盤尺寸減少、母體供胎盤血運的大血管畸形[2]，這些現(xiàn)象在植入NK細(xì)胞后消失，表明uNK細(xì)胞在胚胎植入和妊娠維持中起重要的作用[3]。 近年來，隨著胚胎種植機(jī)理研究的進(jìn)展，人們認(rèn)識到發(fā)育到一定程度的胚胎只有種植在具有最大容受性的內(nèi)膜才能進(jìn)一步生長。對內(nèi)膜種植窗的組化研究發(fā)現(xiàn)，其典型的內(nèi)膜容受性標(biāo)志蛋白分子為avβ3，因此其配體骨橋蛋白(OPN)在生殖中的作用引起極

4、大關(guān)注。OPN是一種分泌型糖基化磷蛋白，是重要細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分，分胞內(nèi)型和胞外型，胞內(nèi)型使細(xì)胞自身遷移活動加強(qiáng)，胞外型可作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，因此OPN參與細(xì)胞的黏附、遷移等多種細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)，是機(jī)體組織或器官發(fā)育過程中一個重要的調(diào)節(jié)因素。目前在生殖領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)：OPN在多種動物例如山羊、狒狒、豬和老鼠的子宮內(nèi)膜和蛻膜中的表達(dá)[4]；Andera.S[5]等學(xué)者曾通過對OPN等位基因缺失和正常鼠的對比研究發(fā)現(xiàn)，OPN等位基因缺失

5、鼠胚胎體積均小于對照組，即宮內(nèi)發(fā)育遲緩。這些發(fā)現(xiàn)都提示了OPN在胚胎的種植和胎盤形成中起重要的作用，并且可能參與子宮內(nèi)膜容受性的建立。但目前的相關(guān)研究報道不多且大多局限于動物實驗研究，而人類與動物的胚胎植入方式又存在著明顯的差異。所以本研究旨在討論OPN在人妊娠早期的母胎界面的表達(dá)，及其孕激素對其調(diào)控影響。本研究首次初步闡述了OPN在人類妊娠早期母胎界面微環(huán)境中的生物學(xué)意義，該研究也將為病理性妊娠發(fā)病機(jī)制及防治的研究提供新的思路和途徑。

6、 第一部分 人妊娠早期母胎界面中OPN的表達(dá)研究 目的 探討人早期妊娠母胎界面組織中OPN的表達(dá)及生物學(xué)意義，旨在為揭示子宮NK細(xì)胞選擇性聚集及胚胎植入的調(diào)控機(jī)制提供新的線索。 方法 1.①選擇9例孕6～9周的正常妊娠婦女，分離其新鮮蛻膜組織，分離蛻膜淋巴細(xì)胞及外周血PBMC；②免疫磁珠法分離純化妊娠早期子宮NK細(xì)胞及外周血NK細(xì)胞；③流式細(xì)胞儀檢測分離NK細(xì)胞的純度；④Trizol法分別

7、提取總RNA；⑤采用RT-PCR技術(shù)檢測OPNmRNA在人妊娠早期子宮NK(uterine，uNK)細(xì)胞和外周血NK(peripheral，pNK)細(xì)胞中的表達(dá)分布。 2.①選擇孕6～9周9例正常妊娠者的標(biāo)本，分離其新鮮蛻膜組織、絨毛組織；②Trizol法分別提取各組織中總RNA；③采用RT-PCR技術(shù)及光密度半定量分析OPN在正常人類早期妊娠流產(chǎn)標(biāo)本中mRNA表達(dá)；④免疫組化技術(shù)檢測OPN在正常人類早期妊娠流產(chǎn)標(biāo)本中蛋白水平的

8、表達(dá)。 結(jié)果 1.人早期妊娠uNK細(xì)胞OPNmRNA的表達(dá)：人早期妊娠uNK及外周血pNK細(xì)胞中均檢測到OPNmRNA的表達(dá)，光密度值半定量分析(OPN/β-actin)顯示：uNK0.78±0.27、pNK0.21±0.19，uNK與pNK細(xì)胞中OPN轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著(P＜0.05)。 2.正常早期母胎界面中的OPN表達(dá)：在9例早期正常妊娠流產(chǎn)標(biāo)本中，蛻膜組織及絨毛組織都有OPNmRNA水平的表達(dá)。免疫組

9、化顯示OPN在全部標(biāo)本的子宮蛻膜組織中腺上皮細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)；絨毛組織中的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，而合體滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)陰性。 結(jié)論 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)了uNK細(xì)胞表達(dá)OPN分子，其與pNK細(xì)胞中OPN表達(dá)有顯著性差異，提示OPN在妊娠早期uNK細(xì)胞選擇性聚集和正常妊娠的維持中可能起重要作用。 2.本研究系統(tǒng)觀察了OPN在人妊娠早期母胎界面的表達(dá)分布，妊娠早期6-9周絨毛、蛻膜組織中OPN呈強(qiáng)陽性表達(dá)，合體

10、滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)陰性。本結(jié)果提示OPN可能與正常妊娠胚胎植入密切相關(guān)。 第二部分 孕酮對人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞OPN的表達(dá)調(diào)節(jié)作用 目的 觀察人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN表達(dá)及孕酮對其表達(dá)的調(diào)節(jié) 方法 ①采用酶消化法對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)；②不同濃度的孕酮(0，10-7，5×10-7,10-6mol/1)刺激傳代培養(yǎng)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞96h；③采用RT-PCR技術(shù)檢測在不同濃度孕酮作用

11、下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPNmRNA表達(dá)變化；④ELISA檢測不同濃度孕酮作用下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞上清中OPN蛋白濃度變化。⑤免疫組織化學(xué)方法檢測同濃度孕酮作用下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 1.人類蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系的建立：采用酶消化法得到人體蛻膜基質(zhì)細(xì)胞懸浮時呈典型的卵圓形，單層培養(yǎng)時為纖維母細(xì)胞狀。接種后30分鐘開始貼壁，逐漸伸長成為纖維母細(xì)胞狀，呈較長的梭形和不規(guī)則星形，核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清晰有

12、豐富的胞質(zhì)顆粒。24小時后細(xì)胞大多貼壁，6-7天可貼壁匯合。傳代后的蛻膜細(xì)胞生長迅速，2-3天即可鋪滿瓶底，鏡下細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形或不規(guī)則星形。傳三代后其形態(tài)無明顯變化，而傳代培養(yǎng)極性漸不明顯。波形蛋白免疫組化顯示體外培養(yǎng)傳代后的細(xì)胞95％以上為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。 2.孕酮對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN的表達(dá)： (1)光密度值半定量分析(OPN/β-actin)顯示：對照組0.15±0.09、低劑量組0.48±0.21、中劑量組0

13、.83±0.16、高劑量組1.21±0.35。不同濃度孕酮作用下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPNmRNA水平隨著孕酮濃度的增加而升高，與未加入孕酮的對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。 (2)ELISA檢測對照組、低、中、高劑量組中培養(yǎng)上清中OPN蛋白的含量分別為4.26±2.23、13.34±3.6、28.02±2.88、47.8±4.87ng/ml，培養(yǎng)上清中OPN的蛋白水平隨著孕酮濃度增加而升高，與未加入孕酮的對照組相比，有顯著

14、性差異(P＜0.05)。 (3)免疫組化檢測對照組、低、中、高劑量組蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN蛋白，Image-ProPlus5.0分析總光密度分別為59.66±6.23、80.61±7.51、99.38±5.52、126.23±6.41，與未加入孕酮的對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)，且孕酮對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN蛋白表達(dá)成劑量依賴性。 結(jié)論 妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OPN，其表達(dá)強(qiáng)度受孕酮的調(diào)控，呈現(xiàn)劑量依賴