氧濃度對蛻膜基質(zhì)細胞成骨分化的影響.pdf

1、目的：
　　 研究發(fā)現(xiàn)，骨組織工程的種子細胞骨髓干細胞數(shù)量有限，取材及增殖分化困難，在臨床應(yīng)用中也受到病人經(jīng)濟條件的制約；而近期研究表明蛻膜基質(zhì)細胞（Decidual Stromal Cells，DSC）可在一定條件下誘導為成骨細胞。本實驗通過體外分離培養(yǎng)人早孕蛻膜基質(zhì)細胞，并對其進行體外培養(yǎng)、擴增；將部分蛻膜細胞向成骨細胞(Osteoblast，OB)方向誘導；觀察常氧、低氧條件下蛻膜細胞的增殖情況及體外成骨能力，探討氧對蛻膜

2、細胞誘導成骨能力的影響。
　　 方法：
　　 取人工流產(chǎn)6～8周妊娠蛻膜組織，采用機械研磨法分離蛻膜，復合酶消化，傳代自然增殖法純化細胞，進行體外培養(yǎng)擴增。倒置顯微鏡觀察其大體形態(tài)，當細胞傳至第五代以后性狀較穩(wěn)定，所以采用第六代蛻膜基質(zhì)細胞進行成骨誘導分化培養(yǎng)。將細胞消化后吹打均勻，分為四組種入6孔板中：(1)DSC常氧對照組(2)DSC常氧成骨誘導培養(yǎng)組(3)DSC低氧對照組(4)DSC低氧成骨誘導培養(yǎng)組。將培養(yǎng)基更換

3、為成骨誘導液，每隔兩至三天換一次液，持續(xù)誘導28天，每7天用PNPP法檢測各組細胞的堿性磷酸酶(ALP)活性的表達，酶標儀測定光密度值（OD值）及茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．機械研磨及復合酶消化結(jié)合傳代自然增殖法純化細胞，獲取高純度的蛻膜基質(zhì)細胞，且保持了較好的細胞活性。
　　 2．蛻膜基質(zhì)細胞在成骨誘導液的作用下，三天后明顯形成集落，細胞明顯變大，并呈明顯的多邊形、三角形、不規(guī)則形

4、，細胞體積比加誘導液之前明顯增大，胞漿透明，內(nèi)含少量顆粒樣或條索樣高密度結(jié)構(gòu)（附圖1，2）；成骨誘導10天，細胞層疊生長，細胞密集，中央可見類似結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)（附圖3）。經(jīng)誘導后的細胞增殖較為緩慢，10～14天細胞才達到90％融合；對照組加入了常規(guī)培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基+10％FBS），細胞體積較小，呈長梭形，偶見多邊形，細胞增殖較快，大約5～7天可達到90％的細胞融合。
　　 3．酶標儀檢測光密度值（OD值）、各組ALP活性表達顯

5、示：DSC常氧成骨誘導培養(yǎng)組的ALP活性表達明顯高于其他三組(P＜0.05);DSC低氧成骨誘導培養(yǎng)組的ALP活性表達明顯高于兩個常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)組(P＜0.05)：
　　 4．四組樣本培養(yǎng)7天，14天，21天，28天后茜素紅染色，成骨誘導組細胞密集區(qū)有礦化結(jié)節(jié)形成（附圖4），茜素紅染色呈橘紅色，常氧成骨誘導培養(yǎng)比低氧成骨誘導培養(yǎng)組明顯，其余兩組未見。
　　 結(jié)論：
　　 1．蛻膜基質(zhì)細胞在一定條件下可以誘導分化為