人早孕期蛻膜CXCR4+ NK細(xì)胞表型與功能調(diào)節(jié).pdf

1、妊娠是一個復(fù)雜的生理過程。從免疫學(xué)角度來看，生理妊娠類似于同種移植，作為同種移植物的胚胎在母體內(nèi)存活直至分娩，實(shí)際上反映母體對胚胎的免疫耐受;在正常妊娠過程中，母體對攜帶父系抗原的胚胎不僅不排斥，而且通過精細(xì)的母-胎對話建立獨(dú)特的母-胎界面免疫耐受微環(huán)境，允許胎兒在母體子宮內(nèi)生長直到分娩;母體對胚胎的免疫排斥將導(dǎo)致妊娠失敗。因此對于母-胎界面免疫耐受的研究對于人類自然流產(chǎn)等妊娠疾患的防治具有重要意義。由于母-胎免疫耐受是自然界免疫逃逸良

2、好的生理性模型，對移植免疫學(xué)和腫瘤免疫學(xué)研究將產(chǎn)生積極推動作用。
　　母-胎界面主要包括滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜腺上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞。其中50-70％的蛻膜免疫細(xì)胞為蛻膜NK細(xì)胞。多年來人們從不同的角度研究母-胎界面發(fā)生的生物學(xué)事件，闡述母-胎免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，其中包括母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢的形成，及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量與功能的變化。近年來占據(jù)母-胎界面免疫細(xì)胞絕大多數(shù)的NK細(xì)胞越來越引起人們關(guān)注。
　　趨化

3、因子是一類由67-127個氨基酸組成的細(xì)胞因子，通過與受體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)作用。一種趨化因子可以和一個或多個受體結(jié)合，一種趨化因子受體也可有多個趨化因子作為配體。通過配受體相互作用，構(gòu)成了人體內(nèi)復(fù)雜的趨化因子網(wǎng)絡(luò)，共同執(zhí)行著復(fù)雜的生物學(xué)功能。對趨化因子的功能的研究最初開始于炎癥;隨研究深入，人們發(fā)現(xiàn)趨化因子不僅具有趨化白細(xì)胞向炎癥局部游走的作用，還參與機(jī)體發(fā)育，腫瘤發(fā)生及進(jìn)展等過程。我們課題組前期已經(jīng)研究了CXCL12/CXCR4在母

4、-胎界面的生物學(xué)功能，及參與母-胎免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。因此，本研究選擇了趨化因子受體CXCR4，研究其在母-胎界面免疫細(xì)胞，特別是蛻膜NK細(xì)胞的分布，以揭示基于CXCR4的蛻膜NK細(xì)胞的獨(dú)特分群以及CXCR4+蛻膜NK細(xì)胞在母-胎免疫調(diào)節(jié)中的作用。
　　第一部分 基于CXCR4表達(dá)的蛻膜NK細(xì)胞的獨(dú)特分群
　　目的:評價(jià)基于表達(dá)CXCR4的蛻膜NK細(xì)胞的表型及功能差異
　　方法:收集正常早孕期婦女外周血，正常非孕育齡期婦女

5、子宮內(nèi)膜組織，正常早孕期婦女蛻膜組織，早孕期無明確原因而自然流產(chǎn)患者蛻膜組織，采用流式細(xì)胞術(shù)分析外周及蛻膜免疫細(xì)胞中基于CXCR4表達(dá)的NK細(xì)胞的表型、細(xì)胞因子的表達(dá)以及細(xì)胞毒活性。
　　結(jié)果:相對于蛻膜CXCR4-NK細(xì)胞，蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞低表達(dá)激活性受體NKp30，NKp44，NKp46;低表達(dá)抑制性受體KIR2DL1，KIR3DL1，CD94;低表達(dá)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α;高表達(dá)Th2型細(xì)胞因子IL-

6、4，IL-10;高表達(dá)IL-8，TGF-β;低表達(dá)穿孔素和顆粒酶。與正常非孕育齡期婦女子宮內(nèi)膜和早孕期無明確原因而自然流產(chǎn)患者蛻膜比較，蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞在正常早孕期婦女蛻膜局部顯著富集。
　　結(jié)論:蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞的表型及功能獨(dú)特，在正常早孕期婦女蛻膜局部顯著富集。
　　第二部分 人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞調(diào)控外周CXCR4+及CXCR4-NK細(xì)胞表型及功能
　　目的:解析人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞對外周CXCR4+及CXCR

7、4-NK細(xì)胞表型及功能的調(diào)節(jié)作用
　　方法:分離純化人早孕外周NK細(xì)胞，外周CXCR4+及CXCR4-NK細(xì)胞，建立人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞與外周NK細(xì)胞或外周CXCR4+及CXCR4-NK細(xì)胞共培養(yǎng)體系，流式細(xì)胞術(shù)分析外周CXCR4+及CXCR4-NK細(xì)胞表型及細(xì)胞因子表達(dá)，及細(xì)胞毒性變化。趨化實(shí)驗(yàn)分析滋養(yǎng)細(xì)胞對于外周NK細(xì)胞的趨化作用。
　　結(jié)果:早孕滋養(yǎng)細(xì)胞上調(diào)外周CXCR4-NK細(xì)胞NKp30，NKp44，NKp46，KIR2

8、DL1，KIR3DL1的表達(dá);上調(diào)外周CXCR4-NK細(xì)胞IFN-γ的表達(dá);上調(diào)外周CXCR4-NK細(xì)胞Perforin和GraB的表達(dá);早孕滋養(yǎng)細(xì)胞下調(diào)外周CXCR4+ NK細(xì)胞NKp30，KIR2DL1，KIR3DL1的表達(dá);下調(diào)外周CXCR4+NK細(xì)胞IFN-γ，TNF-α的表達(dá);上調(diào)外周CXCR4+NK細(xì)胞IL-4IL-10，TGF-β，IL-8的表達(dá);下調(diào)外周CXCR4+NK細(xì)胞Perforin和GraB的表達(dá)。滋養(yǎng)細(xì)胞可上調(diào)

9、外周NK細(xì)胞CD56的表達(dá)，降低外周NK細(xì)胞CXCR4的表達(dá)，使外周NK細(xì)胞的表型向蛻膜NK細(xì)胞發(fā)生偏移。滋養(yǎng)細(xì)胞可使外周CXCR4+NK細(xì)胞朝向蛻膜CXCR4+及CXCR4-NK細(xì)胞分化。早孕滋養(yǎng)細(xì)胞通過分泌CXCL12對外周NK細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。
　　結(jié)論:母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)外周NK細(xì)胞的表型和功能向蛻膜NK細(xì)胞發(fā)生偏移，滋養(yǎng)細(xì)胞可使外周CXCR4+NK細(xì)胞朝向蛻膜CXCR4+及CXCR4-NK細(xì)胞分化。滋養(yǎng)細(xì)胞通過分

10、泌CXCL12對外周NK細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，有利于NK細(xì)胞在母-胎界面富集及發(fā)揮作用。
　　第三部分 蛻膜CXCR4+NK誘導(dǎo)母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢和母-胎耐受
　　目的:解析蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞在母-胎界面Th2型免疫優(yōu)勢和母-胎耐受建立過程中的作用
　　方法:流式細(xì)胞術(shù)分析蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞，蛻膜CXCR4-NK細(xì)胞，外周NK細(xì)胞分別與na(i)ve CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)5天后的na(i)ve CD4+

11、T細(xì)胞膜表面分子、胞內(nèi)細(xì)胞因子和核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平;以及蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞，蛻膜CXCR4-NK細(xì)胞，外周NK細(xì)胞分別與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)5天后的CD4+CD25-T細(xì)胞膜表面分子及核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞上調(diào)Th2型細(xì)胞因子IL-4，核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá);下調(diào)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，核轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，呈Th2型免疫偏移;

12、但對na(i)ve CD4+T細(xì)胞Foxp3的表達(dá)無顯著影響;蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞上調(diào)CD4+CD25-T細(xì)胞PD-1的表達(dá)，誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞，有利于Treg細(xì)胞擴(kuò)增和功能增強(qiáng)。
　　結(jié)論:蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞向Th2型細(xì)胞分化，蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+Foxp3+ Treg細(xì)胞，促進(jìn)母-胎界面Th

13、2型免疫優(yōu)勢和免疫耐受。
　　第四部分 母-胎界面NK細(xì)胞異常導(dǎo)致Th1型偏移及自然流產(chǎn)
　　目的:通過建立正常妊娠，自然流產(chǎn)及NK細(xì)胞刪除孕鼠模型，解析母-胎界面NK細(xì)胞對母-胎界面免疫微環(huán)境及妊娠結(jié)局的作用。
　　方法:建立正常妊娠小鼠模型及自然流產(chǎn)小鼠模型，在小鼠孕10.5天原代分離得到小鼠蛻膜免疫活性細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分別分析孕10.5天小鼠蛻膜Th1/2型免疫偏移，并觀察小鼠胚胎吸收率;建立NK細(xì)胞刪除孕鼠

14、模型和正常妊娠小鼠模型，在小鼠孕10.5天原代分離得到小鼠蛻膜免疫活性細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分別分析孕10.5天小鼠蛻膜Th1/2型免疫偏移，并觀察小鼠胚胎吸收率。
　　結(jié)果:孕10.5天時(shí)，與正常妊娠小鼠相比，自然流產(chǎn)小鼠胚胎吸收率明顯升高，蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞表達(dá)下降，母-胎界面發(fā)生Th1型免疫偏移;孕10.5天時(shí)，與正常妊娠小鼠相比，NK細(xì)胞刪除孕鼠胚胎吸收率明顯升高，母-胎界面發(fā)生Th1型免疫偏移。
　　結(jié)論:早孕

15、期自然流產(chǎn)時(shí)，蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞顯著下降;NK細(xì)胞刪除可致母-胎界面Th1型免疫偏移，及自然流產(chǎn)的發(fā)生，提示蛻膜NK細(xì)胞在正常妊娠的建立和維持中發(fā)揮重要作用。
　　小結(jié):基于CXCR4及CD56的表達(dá)區(qū)分人NK細(xì)胞，早孕期母-胎界面蛻膜CXCR4+NK細(xì)胞呈現(xiàn)耐受表型及Th2型優(yōu)勢，在正常早孕婦女蛻膜組織中顯著富集。滋養(yǎng)細(xì)胞通過分泌CXCL12對外周NK細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，并能夠誘導(dǎo)外周NK細(xì)胞的表型和功能向蛻膜NK細(xì)胞發(fā)生偏