蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞中Tim-3--Tim-3+表達(dá)及其相關(guān)功能研究.pdf

1、第一部分正常孕期蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞Tim-3-/Tim-3+表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究
　　目的
　　研究整個(gè)妊娠過(guò)程子宮局部免疫微環(huán)境中蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞比例及Tim-3-/Tim-3+表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。。
　　方法
　　1.取正常孕6-8周的要求人工流產(chǎn)的婦女25例作為早孕期組。取正常的孕14-20周內(nèi)要求引產(chǎn)的患者13例作為中孕期組,取正常足月剖宮產(chǎn)患者25例作為晚孕期組。取因男方精液異常或者

2、輸卵管堵塞導(dǎo)致不孕的正常未孕婦女25例作為對(duì)照組;本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批,所有研究對(duì)象均簽署知情同意書;
　　2.Ficoll密度梯度離心法分離子宮內(nèi)膜或孕期蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞;
　　3.用直接熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞在整個(gè)妊娠過(guò)程中比例的階段性改變,以及CD56+CD16-NK細(xì)胞Tim-3-/Tim-3+表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果
　　1.蛻膜中CD5

3、6+CD16-NK細(xì)胞表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　蛻膜組織中各組CD56+CD16-NK細(xì)胞比例的表達(dá)情況:與對(duì)照組(23.22％±6.39%)相比,早孕組、中孕組顯著增高(分別為58.10%±6.34%,P<0.05;74.14%±8.67%,P<0.05),晚孕組差異無(wú)顯著性(15.17%±4.77%,P>0.05);與早孕組相比,中孕組表達(dá)增加(P<0.05)。孕期各個(gè)階段CD56+CD16-NK細(xì)胞的比例各組之間差異有顯著性(P<

4、0.05)。
　　2.正常孕期蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞中Tim-3-/Tim-3+表達(dá)的變化
　　蛻膜組織中各組Tim-3+占CD56+CD16-NK細(xì)胞比例的表達(dá)情況:與對(duì)照組(70.75%±2.43%)相比,早孕組、中孕組顯著降低(分別為45.73%±4.82%,P<0.05;59.16%±3.69%,P<0.05),晚孕組差異無(wú)顯著性(72.13%±5.84%,P>0.05);蛻膜組織中各組Tim-3-占CD5

5、6+CD16-NK細(xì)胞比例的表達(dá)情況:與對(duì)照組(29.56%±2.26%)相比,早孕組、中孕組顯著增高(分別為54.68%±4.25%,P<0.05;40.85%±3.31%,P<0.05),晚孕組差異無(wú)顯著性(28.40%±5.24%,P>0.05)。孕期各個(gè)階段,早孕,中孕,晚孕蛻膜組織CD56+CD16-NK細(xì)胞中Tim-3-/Tim-3+比例遞進(jìn)性逐漸降低,其差異有顯著性(P<0.01)。
　　結(jié)論
　　1.早孕期,

6、子宮蛻膜組織中CD56+CD16-NK細(xì)胞的比例逐漸升高,至中孕期達(dá)高峰后開始下降,晚孕期接近未孕水平。
　　2.早孕期,子宮蛻膜組織CD56+CD16-NK細(xì)胞中Tim-3-比例較Tim-3+高,隨著妊娠的發(fā)展,Tim-3-比例逐漸下降,而Tim-3+比例逐漸上升,至妊娠末期,Tim-3+比例占主導(dǎo)地位。
　　第二部分Galectin-9/Tim-3通路對(duì)早孕蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞相關(guān)功能的影響
　　目的<

7、br>　　在第一部分臨床研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討Gal-9/Tim-3通路對(duì)早孕蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞殺傷活性及IFN-γ分泌水平的影響。
　　方法
　　1.免疫磁珠法分選蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀鑒定其純度;
　　2.進(jìn)一步流式分選蛻膜CD56+CD16-Tim-3+NK細(xì)胞與CD56+CD16-Tim-3-NK細(xì)胞;
　　3.ELISA法檢測(cè)兩者IFN-γ分泌的差異;
　　

8、4.LDH釋放法檢測(cè)兩者殺傷活性的差異;
　　5.流式檢測(cè)不同濃度IL-12、IL-18對(duì)CD56+CD16-NK細(xì)胞活化的影響。
　　6.ELISA法檢測(cè)重組Gal-9對(duì)體外培養(yǎng)的活化CD56+CD16-dNK細(xì)胞IFN-γ分泌的影響,及重組Gal-9與阻斷抗體anti-Tim-3聯(lián)合作用對(duì)此類細(xì)胞IFN-γ分泌的影響;
　　7.進(jìn)一步運(yùn)用LDH釋放法檢測(cè)重組Gal-9與阻斷抗體anti-Tim-3對(duì)蛻膜CD56+C

9、D16-NK細(xì)胞殺傷活性的影響。
　　結(jié)果
　　1.免疫磁珠分選后CD56+CD16-NK細(xì)胞純度達(dá)98%以上;
　　2.直接分選出的蛻膜CD56+CD16-Tim-3+NK細(xì)胞與CD56+CD16-Tim-3-NK細(xì)胞IFN-γ分泌量、殺傷活性均無(wú)明顯差異(P>0.05);
　　3.外源性IL-12,IL-18活化后,CD56+CD16-Tim-3+NK細(xì)胞IFN-γ分泌量明顯上升,差異有顯著性(P<0.01)

10、;CD56+CD16-Tim-3+占NK細(xì)胞比例升高,差異有顯著性(P<0.01);
　　4.重組Gal-9使CD56+CD16-dNK細(xì)胞IFN-γ分泌量增多,且呈濃度依賴性(P<0.05);阻斷抗體anti-Tim-3可以抑制Gal-9的活化效應(yīng);
　　5.重組Gal-9對(duì)蛻膜CD56+CD16-Tim-3+NK細(xì)胞殺傷活性的影響無(wú)顯著性(P>0.05)。
　　結(jié)論
　　Gal-9/Tim-3通路可以增加CD

11、56+CD16-NK細(xì)胞IFN-γ的分泌,但對(duì)其殺傷活性無(wú)明顯影響。
　　第三部分孕期蛻膜CD56+CD16-NK細(xì)胞Tim-3-/Tim-3+表達(dá)與病理妊娠相關(guān)性研究
　　目的
　　研究CD56+CD16-NK細(xì)胞在不明原因早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)及子癇前期中的比例變化,以及CD56+CD16-NK細(xì)胞Tim-3-/Tim-3+表達(dá)的異常改變。
　　方法
　　1.取正常孕6-8周要求人工流產(chǎn)的婦女25例作為正常

12、早孕組(早孕組)。取孕8-10周的不明原因早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)17例作為早孕病例組(流產(chǎn)組),取正常足月剖宮產(chǎn)患者25例作為正常晚孕組(晚孕組)。取輕度子癇前期者20例,重度子癇前期者18例作為晚孕病例組(子癇前期組);本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批,所有研究對(duì)象均簽署知情同意書;
　　2.Ficoll密度梯度離心法分離蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞;
　　3.用直接熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)早孕組與流產(chǎn)組,晚孕組與子癇前

13、期組蛻膜中CD56+CD16-NK細(xì)胞比例及CD56+CD16-NK細(xì)胞Tim-3-/Tim-3+比例的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果
　　1.與早孕組(58.10%±6.34%)相比,流產(chǎn)組蛻膜組織中CD56+CD16-NK的比例顯著降低(35.12%±4.71%,P<0.05)。
　　2.與早孕組(45.73%±4.82%)相比,流產(chǎn)組蛻膜組織CD56+CD16-NK細(xì)胞Tim-3+比例升高(62.06%±3.21%,P<0

14、.05);與早孕組(54.68%±4.25%)相比,流產(chǎn)組Tim-3-比例降低(38.00%±3.14%,P<0.05);流產(chǎn)組Tim-3-/Tim-3+比例降低,其差異有顯著性(P<0.05)。
　　3.與晚孕組(15.17%±0.77%)相比,子癇前期組蛻膜組織中CD56+CD16-NK細(xì)胞比例顯著升高(53.21%±6.15%,P<0.05)。
　　4.與晚孕組(72.13%±5.84%)相比,子癇前期組蛻膜組織CD5

15、6+CD16-NK細(xì)胞Tim-3+比例降低(47.74%±2.69%,P<0.05);與晚孕組(28.40%±5.24%)相比,子癇前期組Tim-3-比例升高(52.13%±2.68%,P<0.05);子癇前期組Tim-3-/Tim-3+比例升高,其差異有顯著性(P<0.05)。
　　結(jié)論
　　1.流產(chǎn)組蛻膜組織中CD56+CD16-NK細(xì)胞比例降低,Tim-3-/Tim-3+比例亦低于正常早孕組。
　　2.子癇前期組