CD3bright CD56+ T細胞參與慢性HBV病人干擾素治療無應答和不同NK細胞中miRNA調(diào)控研究.pdf

1、第一部分HBV治療臨床研究
　　乙肝病毒(HBV)感染在全世界范圍普遍存在，雖然乙肝疫苗早在上世紀八十年代開發(fā)并應用，但全球仍有3.5億人是慢性乙肝病毒攜帶者。而中國更是乙肝病毒感染大國，有接近1億人次。慢性乙肝病毒感染(CHB)嚴重影響著大眾的健康，患者有較高的風險罹患肝臟相關(guān)疾病，包括肝臟代謝失調(diào)、肝纖維化、肝硬化、嚴重者甚至發(fā)生原發(fā)性肝癌。因此，尋找有效的方法治療慢性HBV感染非常重要。
　　乙肝病毒在肝臟中的復制是導

2、致肝損傷和疾病的重要原因，所以控制乙肝病毒的病毒載量和相關(guān)抗原的表達成為治療的主要手段。目前為止，臨床普遍應用的乙肝感染治療方法分為三類，長效干擾素;核苷/核苷類似物抗病毒藥物;干擾素聯(lián)合抗病毒藥物治療。其中長效干擾素具有免疫調(diào)節(jié)的活性，治療效果相對較好。然而對于e抗原陽性的CHB病人，48w的peg-IFNα治療后持續(xù)應答率僅占30％左右。乙肝臨床治療效果很差，直接反應了機體（尤其是肝臟）的免疫系統(tǒng)免疫應答功能發(fā)生失調(diào)。
　　C

3、D56+T細胞在肝臟中所占T細胞的比例高達50％，可以通過分泌IFNγ抑制HBV病毒復制。而且CD56+T細胞是抗病毒因子IFNγ的重要來源，甚至多于NK細胞，是主要的抗病毒免疫細胞。然而HBV感染后干擾素治療效果較差，提示我們擁有抗病毒的效應CD56+T細胞可能存在不同的狀態(tài)，并且在HBV感染和治療過程中處于相對抑制狀態(tài)。
　　因此，課題研究目的是探究CD56+T細胞群體在HBV病人感染及治療過程中的作用，揭示長效peg-IFN

4、α臨床治療慢性HBV感染效果不佳的原因，同時希望為HBV臨床治療提供一個預測指標。
　　基于以上研究目的，臨床選取了85例HBeAg陽性的慢性HBV感染病人，通過Peg-IFNα持續(xù)治療48w，之后隨訪觀察24w。在不同時間點(0w、12w、24w、36w、48w、60w、72w)對病毒學指標和免疫學指標進行動態(tài)觀測。經(jīng)過系統(tǒng)的統(tǒng)計和整理分析,取得了以下研究結(jié)果:
　　1、慢性HBV感染病人多數(shù)呈現(xiàn)CD3brightCD56

5、+T細胞狀態(tài)
　　CD56+T細胞在抵抗病毒感染的同時，可能發(fā)揮著免疫調(diào)控作用。為了進一步研究CD56+T細胞在CHB病人中的狀態(tài)，通過流式細胞術(shù)的方法分析了HBV病人和正常人外周血的CD56+T細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV病人相比于正常人，外周血CD56+T細胞的CD3熒光強度表達明顯較高。根據(jù)CD56+T細胞上CD3的熒光強度表達，把病人分為兩種類型，一種是擁有CD3brightCD56+T細胞的CHB病人，一種是擁有CD3dimCD

6、56+T細胞的CHB病人。在所有的85例CHB病人中，64.7％(55/85)比例呈現(xiàn)CD3brightCD56+T細胞類型;對應的，正常人33例樣本中，30.3(10/33)比例呈現(xiàn)CD3brightCD56+T細胞類型。以上結(jié)果顯示CHB病人多數(shù)呈現(xiàn)CD3brightCD56+T細胞狀態(tài)。
　　2、擁有CD3brightCD56+T細胞類型的CHB病人臨床治療效果較差
　　接下來探究CHB病人CD3brightCD56+

7、T細胞類型的存在是否與臨床干擾素治療效果有相關(guān)性。首先，在所有的69例有完整臨床治療數(shù)據(jù)的CHB病人中，發(fā)現(xiàn)擁有CD3brightCD56+T細胞類型的CHB病人臨床指標處于相對偏高狀態(tài)。其次，很大比例(89.4％)的擁有CD3brightCD56+T細胞類型的CHB病人干擾素治療48w之后呈現(xiàn)無持續(xù)應答狀態(tài)，相比之下，僅有59.1％的擁有CD3dimCD56+T細胞類型的CHB病人呈現(xiàn)無應答。最后，無應答病人的CD56+T細胞多呈現(xiàn)C

8、D3熒光強度較高的狀態(tài)。以上結(jié)果說明擁有CD3brightCD56+T細胞類型的CHB病人多數(shù)呈現(xiàn)對干擾素無應答。
　　3、CD3brightCD56+T細胞低表達CD8分子
　　根據(jù)擁有CD3brightCD56+T細胞的乙肝病人臨床治療效果差，猜測CD3brightCD56+T細胞應該處于功能相對低下狀態(tài)。分析了一些功能性相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)了CD8分子在CD3brightCD56+T細胞的表達明顯低于在CD3dimCD56+

9、T細胞的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾素治療不會改變CD3brightCD56+T細胞低表達CD8分子的狀態(tài)。從治療效果角度，無應答病人CD56+T細胞表達CD8分子也相對較低?？傊蓴_素治療的整個過程，CD3brightCD56+T細胞均低表達CD8分子，而無應答病人擁有較少的CD8+CD56+T細胞。
　　4、CD3brightCD56+T細胞高表達NKG2A/CD94分子
　　為了進一步研究CD3brightCD56+T

10、細胞是否處于抑制狀態(tài)，檢測了一些NK細胞及T細胞領(lǐng)域的抑制性分子的表達情況。發(fā)現(xiàn)NKG2A/CD94分子在CD3brightCD56+T細胞的表達明顯高于在CD3dimCD56+T細胞的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾素治療不會改變CD3brightCD56+T細胞高表達抑制性二聚體NKG2A/CD94的狀態(tài)。從治療效果角度，無應答病人CD56+T細胞表達NKG2A/CD94分子也相對較高。總之，干擾素治療的整個過程，CD3brightCD5

11、6+T細胞均高表達NKG2A/CD94分子，而無應答病人擁有較少的NKG2A/CD94+CD56+T細胞。
　　5、CD3brightCD56+T細胞抗病毒能力較差
　　研究報道IFNγ對于機體抗病毒應答非常重要，而peg-IFNα可以誘導多種免疫細胞產(chǎn)生IFNγ。根據(jù)前面結(jié)果所觀測的表型，預測CD3brightCD56+T細胞抗病毒能力較差。通過體外刺激CHB病人的CD3brightCD56+T細胞和CD3dimCD56+

12、T細胞，檢測分泌IFNγ和CD107a的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)CD3brightCD56+T細胞分泌IFNγ和CD107a的能力均較弱。并且干擾素治療不會改變CD3brightCD56+T細胞低表達抗病毒細胞因子的狀態(tài)。由此，證明CD3brightCD56+T細胞抗病毒能力相對較差。
　　6、peg-IFNα過程中，CD3brightCD56+T細胞表面Tim-3表達迅速上升
　　在CHB病人中，Tim-3分子高表達可以抑制很多效應細胞

13、的功能發(fā)揮，包括NK細胞、CD8+T細胞等。然而，干擾素治療之前，Tim-3在CD3brightCD56+T細胞和CD3dimCD56+T細胞表面的表達并沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別。反而在peg-IFNα治療的過程中，CD3brightCD56+T細胞表面Tim-3表達迅速上升，而CD3dimCD56+T細胞表面Tim-3表達平穩(wěn)。Tim-3在CD3brightCD56+T細胞表面的變化與IFNγ有很明顯的負相關(guān)關(guān)系。由此，推測CD3brightCD

14、56+T細胞的功能抑制性分子Tim-3在干擾素治療后迅速表達上調(diào)，可能導致了CD56+T細胞表現(xiàn)出來的功能缺失，IFNγ分泌降低。
　　綜上所述，第一個發(fā)現(xiàn)了慢性HBV感染病人中存在一群CD3brightCD56+T細胞，表型和功能上處于抑制狀態(tài)。這群細胞的存在與臨床干擾素應答低下密切相關(guān)，大比例的CD3brightCD56+T細胞類型CHB病人為干擾素無應答，可以作為一個輔助的干擾素應答情況的預測指標。另外，干擾素治療過程中，T

15、im-3在CD3brightCD56+T細胞迅速上調(diào)，可能是CD56+T細胞功能失調(diào)的重要原因，部分的解釋了CHB病人干擾素治療效果差的原因。
　　第二部分NK細胞基礎(chǔ)研究
　　NK細胞是生物機體抗腫瘤和感染第一防線。不同組織器官中，NK細胞表現(xiàn)出不同的發(fā)育和功能狀態(tài)。比如，蛻膜組織中存在相對未成熟、以產(chǎn)生細胞因子為主的CD56bright NK細胞;外周循環(huán)中存在相對成熟、以發(fā)揮殺傷效應為主的CD56dim NK細胞。

16、r>　　microRNA，是一類非編碼短小RNA，生物機體內(nèi)起著非常廣泛的調(diào)控作用。已有一些研究報道了miRNA調(diào)控NK細胞的發(fā)育和功能，但是研究不同狀態(tài)NK細胞miRNA差異表達調(diào)控的相關(guān)報道相對較少。
　　這部分工作，研究重點放在三種不同NK細胞—外周血NK(pNK)、臍血NK(cNK)、蛻膜NK（dNK）—miRNA特異性表達和差異表達的研究。并據(jù)此，發(fā)現(xiàn)miR-362-5p是NK細胞功能調(diào)控的一個重要miRNA。具體結(jié)果展

17、開如下:
　　1、NK細胞特異性表達miRNA分析
　　對不同淋巴細胞的miRNA基因芯片進行了分析，發(fā)現(xiàn)了dNK、cNK和pNK細胞特異性高表達差異兩倍以上的miRNA;進一步分析，揭示了在三種NK細胞中均高表達兩倍以上的七個miRNA，其中之一是miR-362-5p。
　　2、NK細胞間差異表達miRNA分析
　　接下來，又對三種不同狀態(tài)NK細胞間進行miRNA差異表達分析。在三種NK細胞間兩兩比對，發(fā)現(xiàn)dN

18、K與pNK細胞差異最明顯。進一步發(fā)現(xiàn)miR-362-5p在pNK細胞高相對表達，表明miR-362-5p可能參與NK細胞功能的調(diào)控。
　　3、CYLD是NK細胞中miR-362-5p的靶基因
　　根據(jù)以上結(jié)果，選定miR-362-5p作為研究對象。首先需要確定miR-362-5p在NK細胞中發(fā)揮功能的靶基因。應用TargetScan網(wǎng)站預測miR-362-5p潛在的靶基因，通過雙熒光素酶報告實驗證明了CYLD是miR-362

19、-5p直接作用的靶基因，PCR和蛋白印記方法進一步證明了在NK細胞內(nèi)miR-362-5p同樣可以調(diào)控CYLD的表達。
　　4、過表達或者抑制miR-362-5p可以通過CYLD調(diào)控NK細胞的功能
　　接下來研究miR-362-5p對NK細胞的作用，通過核轉(zhuǎn)染的方法向蛻膜NK細胞中導入miR-362-5p的模擬物，發(fā)現(xiàn)可以促進NK細胞的相關(guān)效應功能;又向外周血NK中導入miR-362-5p的抑制劑敲低miR-362-5p，結(jié)果

20、發(fā)現(xiàn)NK細胞殺傷功能和分泌細胞因子能力明顯降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-362-5p對于NK細胞的功能調(diào)控是通過靶向CYLD實現(xiàn)的。該結(jié)果顯示了miR-362-5p可以正向調(diào)控NK細胞發(fā)揮功能。
　　綜上所述，我們的工作提供了不同狀態(tài)NK細胞（dNK、cNK、pNK）中miRNA的表達特異性，為日后不同NK細胞亞群中分子調(diào)控的研究提供了便利。另外，發(fā)現(xiàn)了miR-362-5p可以調(diào)控NK細胞功能。研究為NK細胞miRNA調(diào)控研究提供了