Tim-3調(diào)控單核-巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化的研究.pdf

1、冠心病是發(fā)達(dá)國(guó)家首位致死性病因,在我國(guó)的發(fā)病率和致死率也逐年升高。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)占冠狀動(dòng)脈性心臟病的絕大多數(shù)(95％-99％),而動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動(dòng)脈急性狹窄和閉塞是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)的重要因?yàn)?。目前研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種多病因的慢性炎癥性疾病,局部和全身的炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)

2、展過程中起著重要作用,固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化病變。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細(xì)胞,其中以巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞最為常見,此外還有少量的樹突狀細(xì)胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細(xì)胞(naturalkiller cell,NK cell)和肥大細(xì)胞(mast cell)等,偶有B淋巴細(xì)胞。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果,目前已發(fā)現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)性因素很多,但相關(guān)針對(duì)治療及

3、控制效果均不理想,降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。越來越多的證據(jù)顯示免疫反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)。免疫缺陷小鼠與正常小鼠相比,動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度減輕約70％；而血清膽固醇水平?jīng)]有改變。因此炎癥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn),對(duì)該機(jī)制的研究將為動(dòng)脈粥樣硬化的治療開辟新的道路。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing

4、molecule-3,Tim-3)是2002年發(fā)現(xiàn)的新型免疫調(diào)節(jié)分子,選擇性表達(dá)在分化終末期的Th1細(xì)胞上。Tim-3與其配體galectin-9結(jié)合后負(fù)向調(diào)控Th1細(xì)胞功能,并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡,介導(dǎo)免疫耐受的形成。大量研究報(bào)道Tim-3通過調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在多種固有免疫細(xì)胞,包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上均有表達(dá),但Tim-3達(dá),而在單核細(xì)胞和NK細(xì)胞上高水平表達(dá)。且冠

5、心病患者單核和NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平顯著高于健康志愿者(單核細(xì)胞,p<0.0001；NK細(xì)胞,p=0.0005),但冠心病患者CD4+和CD8+T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)同健康志愿者無顯著性差異。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果,臨床資料分析結(jié)果顯示單核細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平同多種致病因素呈現(xiàn)良好的相關(guān)性,包括甘油三酯(P=0.0320)和收縮壓(p=0.0016)等,NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平也同甘油三

6、酯(p=0.0121)和膽固醇(p=0.0220)正相關(guān)。
　　 2.動(dòng)脈粥樣硬化患者Tim-3表達(dá)與炎癥水平密切相關(guān)
　　 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示AS患者血清學(xué)炎癥指標(biāo)包括腫瘤壞死因子α(tumernecrosis factor-α,TNF-α)和C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)較健康對(duì)照顯著升高(CRP,p=0.0237；TNF-α,p=0.0235)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和NK細(xì)胞上T

7、im-3的表達(dá)水平與TNF-α及CRP正相關(guān),提示Tim-3與AS病人體內(nèi)炎癥水平相關(guān)。與此相符,分析顯示炎癥水平較高的患者其單核細(xì)胞和NK細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平也相應(yīng)較高,說明Tim-3同動(dòng)脈粥樣硬化患者炎癥水平密切相關(guān),可能參與動(dòng)脈粥樣硬化患者炎癥過程。
　　 以上研究結(jié)果提示,Tim-3參與動(dòng)脈粥樣硬化病變,可能主要通過調(diào)控NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用。
　　 第二部分Tim-3對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的調(diào)控及其在動(dòng)脈粥樣

8、硬化中作用
　　 單核/巨噬細(xì)胞是AS的重要效應(yīng)細(xì)胞。單核細(xì)胞遷移至血管內(nèi)膜以及單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵性起始因素。臨床研究顯示AS患者外周血單核細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高,且與多種致病因素相關(guān),強(qiáng)烈提示單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)的Tim-3參與AS發(fā)生。有研究顯示Tim-3組成性表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞,促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)。然而Tim-3是否參與AS發(fā)生中單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),Tim-3影響單

9、核/巨噬細(xì)胞的哪種效應(yīng),目前尚未見報(bào)道。為了研究Tim-3對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化單核/巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用,本研究利用小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7和AS患者外周血單核細(xì)胞進(jìn)行了一系列體外研究。
　　 1.LPS/ox-LDL活化的鼠單榭巨噬細(xì)胞系RAW264.7中Tim-3表達(dá)顯著升高
　　 炎癥介質(zhì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以有效活化巨噬細(xì)胞,而氧化低密度脂蛋白(oxidized-low d

10、ensity lipoprotein,ox-LDL)是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的重要致動(dòng)脈粥樣硬化因子。免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,LPS和ox-LDL刺激都能夠顯著上調(diào)小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7中Tim-3的表達(dá),而LPS誘導(dǎo)效果較OX-LDL更為強(qiáng)烈,約為ox-LDL誘導(dǎo)效果的兩倍。
　　 2.Tim-3對(duì)單核/巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用
　　 外周血中的單核細(xì)胞釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)參

11、與血管舒張和重構(gòu)等,在動(dòng)脈粥樣硬化中起到積極的保護(hù)作用。但斑塊中單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞吞噬斑塊中的脂質(zhì)成為荷脂細(xì)胞后,釋放大量促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6等介導(dǎo)斑塊局部的炎癥反應(yīng),促進(jìn)斑塊形成和破裂。
　　 結(jié)果提示,Tim-3的確能夠有效抑制LPS/ox-LDL誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞NO的分泌。
　　 3.Tim-3調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞的信號(hào)通路
　　 為了研究Tim-3調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞功能的分子機(jī)制,

12、本研究利用阻斷性抗體阻斷Tim-3信號(hào)后,western blot檢測(cè)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB(nuclear factor-kappa B)通路和MAPK(Mitogen-activatcd protein kinase)通路中的關(guān)鍵分子。
　　 第三部分Tim-3對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)控及其在動(dòng)脈粥樣硬化中作用
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床檢測(cè)證明NK細(xì)胞存在于斑塊形成的各個(gè)時(shí)期,提示NK細(xì)胞在AS發(fā)生中的作用。

13、多篇文獻(xiàn)報(bào)道在AS患者外周血中NK細(xì)胞的活性和數(shù)量顯著下降,然而其機(jī)制尚未闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)Tim-3與其配體結(jié)合可以介導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡,抑制Th1應(yīng)答,同時(shí)文獻(xiàn)證實(shí),Tim-3組成性高表達(dá)于NK細(xì)胞,但Tim-3對(duì)NK功能的影響迄今尚未見報(bào)道。本課題第一部分臨床研究發(fā)現(xiàn),AS患者外周血NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高。為了研究Tim-3對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)控作用,本部分利用人NK92細(xì)胞系和純化的人外周血NK細(xì)胞,體外研究Tim-3過表達(dá)或T

14、im-3阻斷對(duì)NK細(xì)胞活性和數(shù)量的影響。
　　 1.Tim-3抑制NK細(xì)胞活性
　　 冠心病患病危險(xiǎn)度與病原感染相關(guān),而且存在多重感染是冠心病患者發(fā)生心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。NK細(xì)胞是人體第一道防線,在對(duì)病原體,尤其是病毒的防御中起到重要作用。NK主要通過細(xì)胞毒作用和分泌細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)。同時(shí)多篇文獻(xiàn)報(bào)道動(dòng)脈粥樣硬化中NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷導(dǎo)致血管細(xì)胞損傷,可能促進(jìn)了斑塊的形成。因此NK細(xì)胞的殺傷功能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到多

15、重影響。本研究用Tim-3融合蛋白阻斷NK92細(xì)胞Tim-3信號(hào)通路后,以肝癌細(xì)胞系HepG2和乙肝病毒感染的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15為靶細(xì)胞,分別按效靶比1:1,5:1,25:1共孵育,4小時(shí)后CCK-8檢測(cè)殺傷效率,研究Tim-3對(duì)NK殺傷功能的調(diào)控作用。結(jié)果顯示在效靶比5:1和25:1組,Tim-3阻斷后顯著上調(diào)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性,同時(shí)ELISA檢測(cè)顯示Tim-3阻斷后NK92細(xì)胞干擾素-γ(interferon-γ

16、,IFN-γ)分泌增加。說明NK細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)的Tim-3可能抑制其殺傷活性和細(xì)胞因子的分泌。
　　 2.Tim-3對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)
　　 綜合上述結(jié)果,體外研究證實(shí)Tim-3能夠上調(diào)NK細(xì)胞殺傷活性,并通過抑制NK細(xì)胞增殖和促進(jìn)NK細(xì)胞凋亡兩個(gè)途徑導(dǎo)致NK細(xì)胞數(shù)量的減少,這可能是AS患者外周循環(huán)中NK細(xì)胞活性降低和數(shù)量減少的重要機(jī)制。但是NK細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用目前還不明確,多篇文獻(xiàn)認(rèn)為NK細(xì)胞對(duì)病原體感染的

17、清除對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到保護(hù)性作用,但也有研究報(bào)道NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷導(dǎo)致血管細(xì)胞損傷,同時(shí)NK細(xì)胞在不同的動(dòng)物模型中對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響結(jié)論不同,因此NK細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用尚需進(jìn)一步研究。
　　 第四部分Tim-3對(duì)ApoE-/-小鼠斑塊形成影響的體內(nèi)研究
　　 綜上所述,本研究首次證實(shí)Tim.3在AS患者外周血單核/巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)上調(diào),并通過基因轉(zhuǎn)染和抗體阻斷技術(shù),進(jìn)一步研究了Tim-3對(duì)單核/巨噬細(xì)胞