cyclophilinA在單核細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病目前是威脅人類健康的頭號(hào)殺手。深入研究動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的基礎(chǔ)分子機(jī)制，尋找有效的抗動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)，一直是生命科學(xué)研究中最活躍的前沿領(lǐng)域之一。目前認(rèn)為，AS是動(dòng)脈壁對(duì)各種損傷過度表達(dá)的慢性炎癥過程。在此過程中，氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是細(xì)胞損傷的主要原因，活性氧(ROS)是動(dòng)脈粥樣硬化血管炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，ROS激活并促進(jìn)氧化應(yīng)激瀑布鏈，形成惡性循環(huán)，加劇AS進(jìn)程并誘發(fā)斑塊不穩(wěn)定

2、和破裂而發(fā)生嚴(yán)重臨床心血管事件。因此，阻斷氧化應(yīng)激和炎癥過程，已成為當(dāng)前抗動(dòng)脈粥樣硬化研究的重要靶標(biāo)。
　　 cyclophilinA(CyPA)為親環(huán)素家族成員之一，最近研究發(fā)現(xiàn)其在AS斑塊中高表達(dá)，是體內(nèi)對(duì)AS氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的主要活性氧誘導(dǎo)因子之一，在氧化應(yīng)激條件下，CyPA的表達(dá)和分泌增加，并可由細(xì)胞內(nèi)分泌至細(xì)胞外，細(xì)胞分泌CyPA對(duì)心血管疾病的病理、生理起重要的調(diào)節(jié)作用，特別是AS發(fā)生、血管增殖及狹窄等。細(xì)胞外CyP

3、A增強(qiáng)AS進(jìn)程中的主要炎癥細(xì)胞-單核/巨噬細(xì)胞的炎癥活動(dòng)，但是CypA以何種方式與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相互作用，其中的作用機(jī)制以及相關(guān)調(diào)控還不清楚。
　　 在本課題中，我們以體外培養(yǎng)的人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，以體外人的重組cyclophilinA蛋白模擬氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)產(chǎn)物作為刺激，擬從CypA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型中，探討細(xì)胞外CypA對(duì)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用結(jié)果、深層次的作用機(jī)制以及相關(guān)調(diào)控，擬為設(shè)計(jì)

4、和開發(fā)新的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物靶點(diǎn)提供初步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 cyclophilinA在單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用
　　 目的：探討cyclophilinA在單核細(xì)胞氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)中的相關(guān)作用。
　　 方法：人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)，以CypA作為氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)的主要活性氧誘導(dǎo)因子刺激，通過細(xì)胞遷移趨化實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測(cè)CypA對(duì)單核細(xì)胞遷移趨化的影響；炎癥刺激后，酶聯(lián)

5、免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)單核細(xì)胞培養(yǎng)液中主要炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量變化；明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性變化
　　 結(jié)果：(1)CypA作為炎癥刺激，可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移趨化；(2)CypA(200ng/ml)誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6)；(3)CypA(200ng/ml)增強(qiáng)單核細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性；(4)Cyp

6、A對(duì)單核細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌沒有影響。
　　 結(jié)論：(1)CypA對(duì)單核細(xì)胞具有遷移趨化的作用；(2)CypA可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6)，但是對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌沒有影響；(3)CypA可以增強(qiáng)單核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性。
　　 第二部分 cyclophilinA對(duì)單核細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)與炎癥信號(hào)通路的關(guān)系
　　 目的：探討cycloph

7、ilinA對(duì)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的幾種重要炎癥信號(hào)通路的影響；cyclophilinA是否通過某些重要炎癥信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)因子的分泌。
　　 方法：人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)，以CypA作為氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)因子刺激，使用Western blotting方法檢測(cè)了NF-κB炎癥信號(hào)通路、MAPK炎癥信號(hào)通路(包括ERK，JNK，p-38信號(hào)通路)的表達(dá)和EMMPRIN蛋白的表達(dá)；使用ERK1/2通路抑制劑PD980

8、59預(yù)處理細(xì)胞后，Western blotting方法檢測(cè)了NF-κB炎癥信號(hào)通路表達(dá)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)單核細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6)含量、明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性變化。
　　 結(jié)果：(1)CypA能夠激活單核細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路；(2)CypA能夠激活單核細(xì)胞MAPK(包括ERK，JNK，p-38信號(hào)通路)炎癥信號(hào)通路；(3)ERK1/2通路抑制劑PD980

9、59預(yù)處理細(xì)胞后，NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活被抑制；(4)ERK1/2通路抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性被抑制；(5)ERK1/2通路抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后，白介素6(IL-6)分泌沒有變化；(6)CypA對(duì)單核細(xì)胞EMMPRIN的表達(dá)沒有影響。
　　 結(jié)論：(1)CypA能夠激活單核細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路；(2)CypA能夠激活單核細(xì)胞MAPK(包括ERK，JNK，p-3

10、8信號(hào)通路)炎癥信號(hào)通路；(3)CypA通過MAPK炎癥信號(hào)通路來激活NF-κB炎癥信號(hào)通路；(4)CypA通過MAPK-NF-κB炎癥信號(hào)通路增強(qiáng)MMP-9的活性。
　　 第三部分調(diào)控EMMPRIN對(duì)cyclophilinA在單核細(xì)胞促炎癥反應(yīng)中的影響
　　 目的：探討EMMPRIN在cyclophilinA促單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，調(diào)控EMMPRIN對(duì)cyclophilinA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移趨化、炎癥信號(hào)通路激活

11、和炎性細(xì)胞因子釋放的影響。
　　 方法：人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，RNA干擾技術(shù)沉默EMMPRIN基因表達(dá)和/或使用EMMPRIN活性阻滯抗體阻斷EMMPRIN活性的方法干預(yù)處理細(xì)胞后，以CypA作為氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)因子刺激，細(xì)胞遷移趨化實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測(cè)單核細(xì)胞的遷移趨化；使用Western blotting方法檢測(cè)NF-κB炎癥信號(hào)通路和MAPK炎癥信號(hào)通路(包括ERK，JNK，p

12、-38信號(hào)通路)的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)白介素6(IL-6)表達(dá)；明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性。
　　 結(jié)果：(1)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA對(duì)單核細(xì)胞的遷移趨化作用；(2)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA對(duì)單核細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路和MAPK(包括ERK，JNK，p-38信號(hào)通路)炎癥信號(hào)通路的激活；(3)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞MMP-9的活性增