sPLA2-ⅡA慢病毒在人單核細(xì)胞中的表達(dá)及致動(dòng)脈粥樣硬化作用.pdf

1、研究背景
　　 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）是威脅人類健康的主要疾病之一，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的研究一直是心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程十分復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年的研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是一種特殊的炎癥反應(yīng)，“炎癥誘發(fā)的內(nèi)皮損傷-反應(yīng)學(xué)說(shuō)” [1]得到了廣泛的認(rèn)可。
　　 分泌型磷脂酶A2-IIA（secretory phospholipase A2 of g

2、roup IIA，sPLA2-IIA）參與了動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程。炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化的主要特征，其參與了富含脂質(zhì)的粥樣硬化斑塊的形成、進(jìn)展以及破裂過(guò)程，在此過(guò)程中釋放了大量的sPLA2-IIA[2] [3]。sPLA2-IIA為分泌型磷脂酶A2的亞型[4]之一，主要由血管壁平滑肌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，屬于鈣依賴的磷脂酶家族，主要位于巨噬細(xì)胞集聚區(qū)、脂質(zhì)核心區(qū)以及病變內(nèi)膜的細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)。研究表明[5]，sPLA2-IIA通過(guò)影響細(xì)胞的脂質(zhì)

3、代謝，水解動(dòng)脈內(nèi)膜中含有載脂蛋白B-100的磷脂分子，生成游離脂肪酸和溶血磷脂，這些產(chǎn)物可以作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使或進(jìn)一步成為炎性介質(zhì)，從而具有促動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
　　 目的
　　 利用基因體外合成技術(shù)，全基因合成人分泌型磷脂酶A2-IIA基因片段，構(gòu)建含人sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞，并研究其在單核細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)及致動(dòng)脈粥樣硬化炎癥作用。
　　 方法
　　 根據(jù)Gene Bank中

4、sPLA2-ⅡA的基因序列，全基因合成人sPLA2-ⅡA基因片段，構(gòu)建含sPLA2-IIA基因的慢病毒載體。體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞（THP-1），將慢病毒載體轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，分別收集sPLA2-ⅡA和空病毒轉(zhuǎn)染后72h的單核細(xì)胞，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real-time PCR方法檢測(cè)sPLA2-ⅡA mRNA表達(dá)水平與炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和細(xì)胞間粘附分子-1（ICA

5、M-1）mRNA的表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)資料用SPSS13.0軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.擴(kuò)增出人sPLA2-ⅡA基因片段，構(gòu)建含人sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體。測(cè)序表明構(gòu)建的sPLA2-ⅡA慢病毒準(zhǔn)確；
　　 2.體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，慢病毒轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明慢病毒轉(zhuǎn)染真

6、核細(xì)胞成功；
　　 3.利用Real-time PCR方法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與空病毒對(duì)照組相比，含有目的基因的細(xì)胞其sPLA2-ⅡA mRNA表達(dá)水平及炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　 4.轉(zhuǎn)染sPLA2-ⅡA慢病毒的THP-1與ox-LDL共培養(yǎng)，以及與ox-LDL+瑞舒伐他汀共培養(yǎng)，其中含瑞舒伐

7、他汀組其sPLA2-IIA、MCP-1和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建表達(dá)基因重組人sPLA2-ⅡA的慢病毒表達(dá)載體；將含目的基因慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，證實(shí)了細(xì)胞中sPLA2-IIA基因的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致sPLA2-IIA及炎癥因子水平的增加；轉(zhuǎn)染sPLA2-ⅡA慢病毒的THP-1與ox-LDL共培養(yǎng)，以及與ox-LDL+瑞舒伐他汀共培養(yǎng)，其中含瑞舒伐