microRNA-155調控oxLDL刺激樹突細胞參與動脈粥樣硬化免疫炎癥反應的作用及機制.pdf

1、目的:
　　 利用oxLDL刺激人外周血來源DC，找出樹突狀細胞在oxLDL刺激后，細胞水平miRNAs全基因表達譜的變化。挑選其中變化最明顯以及與動脈粥樣硬化關系最密切的miR-155進行深入研究，探討其在樹突狀細胞免疫炎癥生物學過程中的作用機制，并找尋靶基因及其作用機制。同時明確miR-155在AS模型動物中的作用以及在冠心病不同亞型病人中變化。
　　 方法:
　　 Microarray Analysis技術

2、篩選樹突狀細胞及其在oxLDL免疫炎癥刺激過程中表達水平發(fā)生改變的miRNAs，運用Real-time PCR定量檢測并證實相應miRNAs表達水平的改變是否與基因芯片篩選結果一致;同時檢測miRNA在正常小鼠與動脈粥樣硬化模型小鼠以及不同亞型型冠心病病人血清以及外周血來源PBMC中的變化，進一步鎖定上述研究中變化最明顯以及公認免疫炎癥相關分子miR-155進行深入研究，采用miRNAs模擬物/抑制劑轉染人樹突狀細胞并用oxLDL刺激不

3、同時間后，檢測樹突狀細胞分泌炎癥因子的TNF-α及IL6發(fā)生的改變及MAPK信號傳導通路發(fā)生的改變;另一方面，采用膽固醇包裹的agomir注射動脈粥樣模型小鼠，觀察其對動脈粥樣硬化的進程，從體內水平觀察miR-155對動脈粥樣硬化免疫炎癥的作用機制。并用螢火蟲素酶報告基因檢測驗證miR-155在細胞內相對應的靶基因。同時合成靶基因MAP3K10相應的siRNA，單獨轉染樹突細胞，觀察其對免疫炎癥的作用，進一步與miR-155抑制劑共轉染

4、樹突狀細胞觀察靶基因與miRNA之間的相互作用機制。
　　 結果:
　　 MiRNA芯片結果提示樹突細胞在oxLDL刺激48小時后，有100多種miRNA發(fā)生改變，其中上調有的60余種，下調的有40余種，其中以miR-155，miR-146a，miR-146b-5p，miR-29a等差異最為顯著，綜合實驗設計和芯片結果挑選出3個最有意義的miRNA行熒光定量PCR驗證，驗證結果與芯片篩選完全吻合。進一步鎖定miR-155

5、進行研究，發(fā)現(xiàn)其在動脈粥樣硬化模型小鼠中表達明顯增高，在冠心病病人尤其是心梗病人血漿及PBMC中表達也明顯增高，功能研究發(fā)現(xiàn)miR-155能減少oxLDL作用樹突細胞炎癥因子TNF-a，IL-6表達，抑制MAPK信號通路p38，JNK,ER磷酸化的活化，上述炎癥效應同樣在動脈粥樣模型小鼠中得到驗證，同時miR-155能夠一定程度上改善動脈粥樣硬化進程。生物信息學預測其靶基因是MAP3K10，熒光定量PCR以及Western-blot證明

6、miR-155能減少MAP3K10的表達，螢火蟲素酶報告基因檢測驗證miR-155能減少MAP3K103'UTR的表達，同時，MAP3K10對樹突細胞免疫炎癥效應能夠被miR-155所抵消，證明其是功能相關的靶基因。
　　 結論:
　　 MiR-155在動脈粥樣模型小鼠及冠心病病人中表達明顯增加，miR-155能夠通過靶基因MAP3K10調控動脈粥樣硬化免疫炎癥過程，抑制炎癥因子分泌，抑制MAPK信號通路活化，并在一定程