動脈粥樣硬化的免疫炎癥機制及三七皂苷的調(diào)控作用.pdf

1、背景與目的：大量的臨床和流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)慢性炎癥患者和自身免疫性疾病患者AS發(fā)病率明顯升高，提示免疫炎癥與動脈粥樣硬化存在密切關系。由于以往的研究所用的模型均缺乏免疫炎癥反應直接誘發(fā)AS這種特異性，不能很好的說明免疫炎癥反應和AS之間的確切關系。那么究竟免疫炎癥是引起AS的病因還是AS的伴發(fā)現(xiàn)象?這是目前亟待解決的關鍵問題。鑒于嚙齒類動物AS病變更類似人類，因而制備一種方便可靠的嚙齒類動物免疫炎癥性AS模型，對于研究相關機制來說是必要的

2、。細胞因子是免疫炎癥反應的代表性產(chǎn)物和刺激物，明確眾多細胞因子在AS中的變化規(guī)律有助于進一步探尋免疫炎癥機制的作用規(guī)律及其意義?？贵w芯片技術為此提供了可靠的技術手段。核轉錄因子NF-κB、AP-1是調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和細胞因子生成的上游共享分子，JNK和p38是與炎癥反應密切相關的信號轉導分子，因此，明確AS病變中免疫炎癥相關因子的動態(tài)變化及信號分子NF-κB、AP-1、JNK和p38的變化對于揭示AS病變的免疫炎癥機制具有重要意義。三七皂苷

3、具有抗AS的作用，對多種急慢性炎癥有顯著療效并具有免疫調(diào)節(jié)作用，有理由推測三七防治AS的機制與其調(diào)節(jié)免疫炎癥效應有關。因此，通過采集AS病灶部位及泡沫細胞中多種化學信號分子的動態(tài)變化數(shù)據(jù)，不但有助于揭示細胞信號轉導的某些規(guī)律，更重要的是為探索中藥三七防治AS的免疫炎癥調(diào)節(jié)機制提供極有價值的線索。 方法： 1、無菌條件下腹腔注射酵母多糖(Zym)—液體石蠟混懸液20mg/kg體重，間隔5天給藥一次，觀察Zym在大鼠體內(nèi)致炎

4、效果。采用免疫和炎癥刺激的方法(Zym疊加卵蛋白)在高脂喂養(yǎng)的基礎上誘導大鼠AS的形成，探討免疫炎癥與AS之間的關系，同時以求獲得免疫炎癥因素誘導的大鼠AS模型。 2、在我室既往基因芯片檢測的基礎上，采用細胞因子抗體芯片并行檢測免疫炎癥刺激因素下3、6、10周時形成的AS中炎性相關因子的動態(tài)變化及三七皂苷的影響，以期探索炎癥相關因子在AS形成過程中的作用規(guī)律及其意義，為尋找防治AS的分子靶點提供實驗資料和線索。 3、采用

5、免疫組化方法，檢測免疫炎癥性AS病變局部3、6、10周時NFkB/P65、c-Jun/AP-1的動態(tài)變化；oxLDL、oxLDL+Zym、oxLDL+Zym+PNS50μg、oxLDL+Zym+PNS100μg分別作用于小鼠腹腔巨噬細胞，誘導泡沫細胞形成，利用westemblot技術檢測JNK和p38磷酸化水平。 結果： 1、間編5日一次腹腔注射酵母多糖一液體石蠟混懸液20mg/kg，給藥兩次后，白細胞計數(shù)顯示24小時即

6、明顯升高達高峰，48小時-120小時保持高水平與給藥前比較有顯著差異，144小時后即二次給藥后6天時降至正常水平，動物無一死亡。表明此方法可以引發(fā)大鼠體內(nèi)可控制的炎癥反應。在高脂飲食的基礎上，應用Zym疊加OVA刺激大鼠10周，模型組大鼠血清總膽固醇及循環(huán)免疫復合物均明顯高于高脂對照組，電鏡觀察顯示10周末模型組主動脈壁可見血源性泡沫細胞形成。 2、抗體芯片顯示，3周時模型組動脈壁中IL-1α、MCP-1、TNF-α三種致炎因子

7、處于明顯升高狀態(tài)；PNS可以明顯抑制IL-1a、MCP-1的水平，但對TNF-α作用不明顯。6周時有更多的趨化因子表達增加如CINC-2、CNTF、FKN、LIX，此時IL-6開始升高，PNS對它們的抑制作用明顯。10周時，除了一些趨化因子和炎癥免疫因子的增加外，還檢測到GM-CSF、IFN-γ、Leptin的明顯升高，它們在促進泡沫細胞形成中具有顯著作用，可能是在此前持續(xù)的免疫炎癥反應的基礎上最終導致泡沫細胞形成的關鍵因素，這與此時電

8、鏡切片可以觀察到泡沫細胞相一致。PNS同樣能夠降低三者的水平。在大鼠動脈壁泡沫細胞形成的整個過程中，4種細胞因子處于持續(xù)升高趨勢，包括CINC-2、CNTF、LIX、VEGF；6種呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，包括CINC-3、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、Leptin、β-NGF；5種因子包括Fractalkine、IL-6、IL-1α、IL-10、TNF-α處于波動狀態(tài)；MCP-1在3周時明顯升高，其它時相點變化幅度不大，MIP-3a、

9、TIMP-1、IL-4在整個病變過程中變化幅度始終較平穩(wěn)。IL-4、IL-10目前被認為在AS中是抗炎抗動脈硬化的因子，我們發(fā)現(xiàn)除IL-10在6周時有所升高外均處于降低或變化平穩(wěn)的狀態(tài)。 3、在AS模型大鼠主動脈壁中，NF-κB/P65主要表達于內(nèi)皮細胞和內(nèi)膜下間隙的炎癥細胞，外膜層亦有少量表達，胞核可見明顯的陽性表達顆粒。表明這些陽性細胞中NF-κB均處于活化狀態(tài)。模型組3周時NF-κB即有明顯升高，并隨著病程的進展呈進行性增

10、高趨勢，而在高脂對照組并未呈現(xiàn)出模型組中NF-κB表達的進行性升高趨勢。c-Jun/AP-1的表達陽性細胞位于動脈壁全層，包括內(nèi)皮細胞、內(nèi)膜下層炎性細胞、平滑肌細胞等；并且3周時c-Jun/AP-1的表達即呈現(xiàn)明顯升高，此后6、10周時處于持續(xù)升高狀態(tài)。三七皂苷對二者的高表達均有明顯的抑制作用。酵母多醣在體外可以明顯促進巨噬細胞源性泡沫細胞的形成，泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積量也明顯升高并且PNS對其有明顯的抑制作用，ox-LDL組少量表達p-p

11、38、p-JNK。oxLDL+Zym組中p-p38、p-JNK的表達明顯高于ox-LDL對照組。oxLDL+Zym+PNS501μg組、oxLDL+Zym+PNS100μg組中p-p38、p-JNK的表達量明顯減少。在檢測JNK磷酸化的結果中發(fā)現(xiàn)，僅檢測出54KD的JNK2，卻沒有發(fā)現(xiàn)46KD的JNK1。PNS能有效的抑制Zmy對ox-LDL刺激引起的巨噬細胞源性泡沫細胞中p38、JNK的磷酸化的增強作用，并呈劑量依賴性。 結論

12、： 1、我們應用Zym誘發(fā)無菌性炎癥疊加OVA接種刺激機體免疫反應誘導大鼠動脈壁泡沫細胞形成，成功建立了一種嚙齒類(大鼠)免疫炎癥性AS模型，這同時也證明，除高血脂之外免疫炎癥反應也是導致AS的重要原因。 2、抗體芯片檢測AS病變局部細胞因子的動態(tài)變化顯示，炎癥免疫因素誘發(fā)AS形成的不同階段，由不同的炎癥免疫因子起到主導作用，導致了抗炎和致炎因子的失衡，這可能就是單純控制血脂水平的情況下心血管疾病的發(fā)病率仍在持續(xù)上升以及

13、自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病患者動脈粥樣硬化發(fā)病率大幅升高等臨床現(xiàn)象的原因。 3、在免疫炎癥性AS病變中，NF-κB/p65處于進行性升高的趨勢，c-Jun/AP-1在病變的起始階段即明顯升高，并持續(xù)處于高水平。二者的高表達是免疫炎癥狀態(tài)下細胞因子紊亂的機制之一，干預這兩個上游共享分子可以調(diào)控紊亂的細胞因子表達。 4、p38、JNK的異常激活涉及了oxLDL疊加Zym誘導泡沫細胞形成的過程，其中JNK2是泡沫細胞形成中

14、JNK活化的主要亞型。表明在免疫炎癥性AS過程中，活化的JNK和p38可以通過增強多種轉錄因子包括AP-1和NF-κB的轉錄活性而調(diào)節(jié)細胞因子和炎性介質(zhì)的表達。 5、在免疫炎癥性AS中，由于細胞因子之間的網(wǎng)絡作用，如果只單獨干預某一個因子不能產(chǎn)生很好的治療效果。三七皂苷能夠在AS早期階段調(diào)控整體細胞因子的水平，這可能是其抗AS療效顯著的重要原因。三七皂苷對NF-κB、AP-1、p38、JNK異常激活的抑制作用可能是其調(diào)控細胞因子