激活NNMR抗動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化為嚴(yán)重危害公眾健康的常見病和多發(fā)病，是致殘和致死率高的冠心病和腦卒中的病理學(xué)基礎(chǔ)之一。炎癥反應(yīng)學(xué)說是當(dāng)今最主要的動脈粥樣硬化學(xué)說之一。該學(xué)說與脂質(zhì)浸潤學(xué)說相輔相成，其基礎(chǔ)是損傷反應(yīng)學(xué)說，被免疫學(xué)說所拓展。損傷反應(yīng)學(xué)說強(qiáng)調(diào)的對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和免疫學(xué)說提出的免疫細(xì)胞功能的紊亂揭示了非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)可能在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)廣泛地分布于內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中，在人

2、類的各種組織器官中均有存在。其與神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)在乙酰膽堿合成、儲存、釋放、滅活、受體和作用方式等方面均有所不同。非神經(jīng)性M受體(NNMR)和神經(jīng)性M受體(NMR)具有不同的藥理特性。非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，免疫應(yīng)答，神經(jīng)發(fā)育等各種重要生理功能。然而，尚沒有關(guān)于非神經(jīng)性乙酰膽堿系統(tǒng)與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)NNMR激動劑檳榔堿誘導(dǎo)離體大鼠主動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，可被阿托品10μM

3、和NNMR特異性拮抗劑山莨菪堿0.01～10nM劑量依賴性阻斷，而能激活所有亞型NMR的毛果蕓香堿即使是在高達(dá)100μM時(shí)仍不能誘發(fā)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)；檳榔堿(1mg/kg/d-5mg/kg/d)在高脂飲食誘發(fā)兔的動脈粥樣硬化模型上對抗動脈粥樣硬化形成，保護(hù)血管內(nèi)膜，而毛果蕓香堿5mg/kg/d不影響動脈粥樣硬化的形成，在高血脂誘發(fā)鵪鶉動脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，NNMR特異性拮抗劑1s-2α-2R-CHPET加重動脈粥樣硬化樣病理損傷；

4、在角叉菜膠誘發(fā)的小鼠尾動脈血栓模型上檳榔堿在0.1～4.0mg.kg<'-1>范圍內(nèi)激活NNMR可劑量依賴性地對抗血栓形成，而毛果蕓香堿在劑量高達(dá)檳榔堿最低有效劑量的40倍，即4.0mg．kg<'-1>時(shí)充分激活M受體，對血栓形成仍無明顯影響。提示檳榔堿所作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞上的NNMR與神經(jīng)性M受體在藥理學(xué)特征上存在顯著差異，故不能被神經(jīng)性M受體激動劑毛果蕓香堿所激活；由于檳榔堿的作用被山莨菪堿所阻斷，表明檳榔堿通過激活NNMR而舒張血

5、管、抗血栓及抗動脈粥樣硬化。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究從體內(nèi)到體外，在高脂飲食誘發(fā)ApoE<'-/->小鼠動脈粥樣硬化模型及ox-LDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化樣炎癥反應(yīng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞上，進(jìn)一步研究激活NNMR抗動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)特點(diǎn)以及分子途徑。 一、激活．NNMR抗動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)機(jī)制的體內(nèi)(in viva)研究 在高脂飲食誘發(fā)高血脂和動脈粥樣硬化的ApoE<'-/->小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，檳榔堿治療組分別給予7

6、和21mg/kg/d口服給藥7周，以未給檳榔堿的ApoE<'-/->小鼠作為模型對照，以普通飲食的野生型C57BL/6J小鼠作為正常對照，采用HE染色、電鏡觀察、免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿(7和21mg/kg/d)可顯著減小高脂飲食ApoE<'-/->小鼠主動脈根部的動脈粥樣硬化斑塊面積和改善血管內(nèi)皮動脈粥樣硬化樣損傷，具有顯著的抗動脈粥樣硬化作用。其抗炎效應(yīng)

7、主要為顯著下調(diào)血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、單核趨化蛋白-1(MCP-1)的基因和蛋白表達(dá)，抑制T淋巴細(xì)胞活化介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。檳榔堿對于T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的作用表現(xiàn)在三個方面：1)顯著抑制主動脈粥樣硬化斑塊處T淋巴細(xì)胞的浸潤，抑制脾臟中T淋巴細(xì)胞的增殖和CD4+/CD8+的升高；2)顯著下調(diào)主動脈上激活T淋巴細(xì)胞所需要的協(xié)同共刺激因子VLA-4、CD28、CD86和CD40L的基因表達(dá)；3

8、)顯著下調(diào)Th1型促炎相關(guān)細(xì)胞因子IFNγ和IL-12在主動脈和脾臟的基因表達(dá)，上調(diào)。Th2型抗炎相關(guān)細(xì)胞因子IL-10在主動脈中基因的表達(dá)；并顯著減少了T淋巴細(xì)胞特異性刺激劑刀豆蛋白刺激的體外培養(yǎng)的高脂飲食ApoE<'-/->小鼠的脾臟細(xì)胞分泌IFNγ，增加IL-10的產(chǎn)生。另一方面，檳榔堿可增加高脂飲食ApoE<'-/->小鼠血清NO含量，抑制主動脈NFκBp65亞基的基因和蛋白表達(dá)及活性，并上調(diào)主動脈PPARγ基因的表達(dá)。

9、 二、激活內(nèi)皮細(xì)胞上NNMR抗動脈粥樣硬化樣炎癥反應(yīng)機(jī)制的體外(in vitro)研究 在動脈粥樣硬化誘導(dǎo)因子ox-LDL的作用下，大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中單核趨化蛋白-1(MCP-1)基因表達(dá)增加，分泌MCP-1增多，并促進(jìn)了單核細(xì)胞向內(nèi)皮的粘附和遷移。檳榔堿濃度依賴地抑制了上述ox-LDL誘導(dǎo)的病理改變。免疫組化顯示了檳榔堿顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的NFκB核轉(zhuǎn)位，凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)則揭示了檳榔堿顯著減弱NFKB與DNA的結(jié)合活性

10、。檳榔堿抑制MCP-1基因表達(dá)、分泌、單核細(xì)胞粘附和NFκB-DNA結(jié)合活性的作用被M受體的拮抗劑阿托品所阻斷。表明檳榔堿通過激活內(nèi)皮細(xì)胞NNMR發(fā)揮抗炎作用。 三、靶向內(nèi)皮細(xì)胞NNMR哌芳安他抗動脈粥樣硬化樣炎癥反應(yīng)新機(jī)制的體外(in vitro)研究 哌芳安他是以內(nèi)皮細(xì)胞NNMR為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的新結(jié)構(gòu)化合物，已經(jīng)證明具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞活性和抗動脈粥樣硬化作用。在ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞上，哌芳安他促進(jìn)生成N

11、O，從而顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的MCP-1分泌和單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了哌芳安他顯著上調(diào)ox-LDL抑制的PPARγ,的基因表達(dá)。 在先前研究的基礎(chǔ)上，本課題在高脂飲食誘發(fā)動脈粥樣硬化的ApoE<'-/->小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕线M(jìn)一步研究檳榔堿激活NNMR抗動脈粥樣硬化的特點(diǎn)和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)檳榔堿可通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞免疫活性和Th1/Th2反應(yīng)的平衡而抑制炎癥反應(yīng)，可通過生成NO、抑制NFκB活性和促進(jìn)PPARγ基因表達(dá)而抗動