激活瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管病是全球引起死亡的首要原因。目前認(rèn)為AS是一種與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的全身血管的慢性炎癥性疾病,基本的病理生理過程主要是內(nèi)皮細(xì)胞的受損以及血液單核-巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞在血管壁的沉積形成泡沫細(xì)胞,尤其在形成的晚期,主要是VSMC起作用。在內(nèi)源性配體氧化低密度脂蛋白的刺激下,VSMC內(nèi)膽固醇不斷增加轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,泡沫細(xì)胞凋亡釋放出炎性物質(zhì)進(jìn)一步加重動(dòng)脈粥樣硬化炎性病灶的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)

2、胞泡沫化的核心是細(xì)胞內(nèi)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生紊亂,涉及細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取和轉(zhuǎn)出異常,目前研究證實(shí)在人、大鼠、兔的平滑肌細(xì)胞上均存在膽固醇的攝取和轉(zhuǎn)出的一系列受體蛋白,包括低密度脂蛋白受體,低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1,ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體1,提示平滑肌細(xì)胞可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的脂質(zhì)沉積,但是具體機(jī)制目前尚未明確。
　　 既往研究發(fā)現(xiàn),辣椒中的主要辣味成分辣椒素在減少炎癥反應(yīng)、減少體脂聚集、調(diào)節(jié)血脂及能量代謝等方面也有積極的作用,這種辣

3、椒素的效應(yīng)與兒茶酚胺水平升高有關(guān),而是否與辣椒素的受體--瞬時(shí)受體電位香草醛亞家族1有關(guān)尚不明確。
　　 神經(jīng)細(xì)胞TRPV1通道可被高溫、酸性環(huán)境、脂質(zhì)、辣椒素等物質(zhì)激活,導(dǎo)致以Ca2+為主的跨膜離子流動(dòng),進(jìn)而激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào),參與多種傷害性刺激的分辨、整合以及炎癥反應(yīng)。除神經(jīng)系統(tǒng)外,TRPV1在血管、脂肪、肌肉、肝臟和胰腺均有分布,但對(duì)其在心血管和代謝中的作用研究甚少。我們研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可激活脂肪細(xì)胞。TRPV1導(dǎo)致細(xì)胞

4、內(nèi)鈣增加,減少脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的堆積,長期辣椒素干預(yù)可預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TRPV1在大鼠平滑肌細(xì)胞也有表達(dá),其生理意義還不清楚。炎癥反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡都是動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要環(huán)節(jié),并且受細(xì)胞鈣信號(hào)的調(diào)控,因此,我們推測,激活平滑肌細(xì)胞TRPV1可能通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化影響血管炎癥反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡,從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。
　　 為了驗(yàn)證上述推測,本研究分為三部分進(jìn)行。第一部分采用蛋白免

5、疫印跡、RT-PCR、免疫熒光染色及比率熒光成像系統(tǒng)等技術(shù),探討TRPV1在小鼠主動(dòng)脈組織和平滑肌細(xì)胞表達(dá)、分布及其相應(yīng)功能。第二部分分題一選用原代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象,從離體水平探討激活TRPV1對(duì)平滑肌源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響。分題二采用ApoE基因敲除型(ApoE-/-)小鼠作為研究對(duì)象,從藥物活性水平探討激活TRPV1后血清中炎癥因子(TNF-α,IL-6,hs-CRP)、血脂水平的變化及其對(duì)主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響

6、;分題三選用遺傳學(xué)技術(shù)建立TRPV1ApoE雙基因敲除(TRPV1-/-ApoE-/-)小鼠作為研究對(duì)象,從基因水平探討TRPV1基因敲除對(duì)主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響。分題四選用Wistar大鼠作為研究對(duì)象,以高脂飲食作為干預(yù)手段,研究血管旁脂肪對(duì)AS血管重構(gòu)和功能及TRPV1、AMPK//mTOR信號(hào)分子的作用。第三部分采用蛋白免疫印跡、免疫熒光染色等分子生物學(xué)技術(shù),探討激活TRPV1主動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞上相關(guān)炎癥因子(MCP1、TNF-

7、α、CRP)、粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)及脂質(zhì)代謝相關(guān)受體(ABCA1、LRP1、CD36、SR-A)蛋白表達(dá)水平及其機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 整個(gè)研究采用離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。離體實(shí)驗(yàn)主要以原代培養(yǎng)的C57BL/6J野生型和TRPV-/-小鼠的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象。在體實(shí)驗(yàn)以ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠、Wistar大鼠作為研究對(duì)象,ApoE-/-和

8、TRPV1-/-ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為普食組(ND組),高脂組(HD組),普食加辣椒素組(Ncaps組)和高脂加辣椒素組(Hcaps組)。Wistar大鼠隨機(jī)分為普食組(Control組),高脂組(HFD組)。
　　 1.采用蛋白免疫印跡、RT-PCR、免疫熒光染色等分子生物學(xué)技術(shù),探討TRPV1在小鼠主動(dòng)脈組織和平滑肌細(xì)胞表達(dá)和分布。
　　 2.選用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象

9、。以TRPV1激動(dòng)劑及其特異性拮抗劑作為藥物干預(yù)手段,利用比率熒光成像系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I變化。
　　 3.利用遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建TRPV1-/-APOE-/-雙基因敲除小鼠。
　　 4.利用生化分析儀等儀器,采用生化檢驗(yàn)技術(shù)及放免法檢測血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、炎癥因子(TNF-α,IL-6,hs-CRP)血糖、胰島素等生化指標(biāo),均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

10、>　　 5.以ApoE4-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈為研究對(duì)象,采用油紅O染色技術(shù)檢測主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積的情況,采用天狼猩紅染色技術(shù)檢測主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原纖維的表達(dá):采用免疫組化染色技術(shù)檢測主動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及脂質(zhì)代謝相關(guān)受體(ABCA1和LRP1)的表達(dá)水平。
　　 6.采用Wistar大鼠作為研究對(duì)象,采用維多利亞蘭染色檢測主動(dòng)脈中膜厚度,采用HE染色觀察血管旁脂肪的形態(tài);采用小

11、血管功能儀檢測血管活性;采用蛋白免疫印跡法檢測主動(dòng)脈eNOS、TRPV1及AMPK/mTOR增殖信號(hào)分子表達(dá)。
　　 7.選用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠主動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象,以TRPV1激動(dòng)劑辣椒素、鈣離子載體A23187等藥物作為干預(yù)手段,采用蛋白免疫印跡法檢測主動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞上脂質(zhì)代謝相關(guān)受體(ABCA1和LRP1)、炎癥因子(MCP1、TNF-α、CRP)及粘附分子(P-selectin、VC

12、AM-1、ICAM-1)的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.TRPV1在主動(dòng)脈和血管平滑肌細(xì)胞上均有表達(dá),TRPV1激動(dòng)劑可上調(diào)TRPV1表達(dá)。
　　 2.TRPV1激動(dòng)劑可呈濃度依賴性地引起的VSMC內(nèi)游離鈣離子的增加,而這種細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)變化可被TRPVl拮抗劑或TRPV1-/-所抑制。
　　 3.激活TRPV1可減少平滑肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積,TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能減少平滑肌細(xì)胞內(nèi)脂

13、質(zhì)蓄積。
　　 4.激活TRPV1可顯著降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血清總膽固醇、甘油三酯水平,而對(duì)高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血脂水平?jīng)]有影響。
　　 5.激活TRPV1后可顯著降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血清hs-CRP、TNF-α和IL-6的水平,對(duì)高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血清炎癥因子水平?jīng)]有影響。
　　 6.高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈根部及腹主動(dòng)脈的脂質(zhì)斑塊

14、面積較高脂加辣椒素喂養(yǎng)組明顯增加,而TRPV1-/-ApoE-/-小鼠兩組間沒有顯著差異。比較ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-各組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及膠原纖維成份,結(jié)果顯示激活TRPV1對(duì)斑塊內(nèi)上述成份的表達(dá)沒有影響。高脂加辣椒素喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠與高脂喂養(yǎng)小鼠比較斑塊內(nèi)CD3表達(dá)減弱,脂代謝相關(guān)受體ABCA1表達(dá)增加,而LRP1表達(dá)減弱。
　　 7.成功構(gòu)建了TRPV1-/-ApoE-/-小鼠。與

15、同窩ApoE-/-小鼠相比,TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血清中炎癥因子(hs-CRP,TNF-α,IL-6)水平升高:血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平升高;TRPV1-/-ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積增加,斑塊內(nèi)CD3表達(dá)增強(qiáng),脂代謝相關(guān)受體ABCA1表達(dá)減弱,而LRP1表達(dá)增強(qiáng)。
　　 8.激活TRPV1可顯著上調(diào)主動(dòng)脈和平滑肌細(xì)胞ABCA1的表達(dá),而下調(diào)LRP1的表達(dá)。TRPV1基因敲除蛋白表達(dá)水平

16、變化不明顯。
　　 9.血管旁脂肪能夠明顯減少主動(dòng)脈和腸系膜小動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血舒張反應(yīng),且高脂誘導(dǎo)后主動(dòng)脈eNOS的表達(dá)下調(diào),主動(dòng)脈TRPV1功能受損,并伴隨著AMPK/mTOR增殖信號(hào)通路的改變。
　　 10.激活TRPV1使小鼠主動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞炎癥因子(MCP1、TNF-α、CRP)、粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)、脂代謝相關(guān)受體LRP1表達(dá)減弱,而脂代謝相關(guān)受體ABCA1表達(dá)則顯著增

17、強(qiáng),TRPV1基因敲除則可抑制這種改變。
　　 11.鈣離子載體.A23187可顯著上調(diào)平滑肌細(xì)胞ABCA1的表達(dá),下調(diào)LRP1的表達(dá)。TRPV1基因敲除蛋白表達(dá)水平變化不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.TRPV1在小鼠主動(dòng)脈和VSMC中均有表達(dá)。TRPV1激動(dòng)劑可呈濃度依賴性地引起的VSMC內(nèi)游離鈣離子的增加。TRPV1激動(dòng)劑還可上調(diào)TRPV1的表達(dá)。這說明主動(dòng)脈和VSMC中存在TRPV1通道的功能性表達(dá)。

18、r>　　 2.激活TRPV1可降低小鼠血清中的炎癥因子、總膽固醇和甘油三酯水平。激活TRPV1還可減少VSMC內(nèi)脂質(zhì)聚集及減少高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈中AS斑塊的形成。而TRPV1基因敲出后上述各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的加重,提示TRPV1參與AS形成的調(diào)節(jié)。另外高脂誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈TRPV1功能受損,并伴隨著血管重構(gòu)及功能障礙。
　　 3.激活TRPV1可上調(diào)ABCA1的表達(dá),而下調(diào)LRP1的表達(dá),同時(shí)可顯著下調(diào)多種炎癥因子,提示