孤兒核受體Nur77在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制中的作用研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是多種心血管危險(xiǎn)因素及免疫機(jī)制共同參與的慢性炎癥性過程,是威脅人類健康的主要疾病。深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的病理分子機(jī)制,延緩斑塊的進(jìn)展,使斑塊趨于穩(wěn)定,尋找有效地抗動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn),一直是心血管病研究的熱點(diǎn)。
　　 氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)與巨噬細(xì)胞間存在交互式應(yīng)答,在動(dòng)脈粥樣硬化開始,進(jìn)展,斑塊的激活過程中起著關(guān)鍵性的作用。oxLDL是一種重要的促炎因子,能激活炎癥細(xì)胞,增加炎性因子的釋放,又是一種強(qiáng)烈的促

2、凋亡的因子,能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡,繼發(fā)壞死,導(dǎo)致斑塊破裂,引起一系列臨床事件。激活的炎癥和巨噬細(xì)胞的凋亡是斑塊不穩(wěn)定的重要因素,因此,明確oxLDL激活的巨噬細(xì)胞中基因調(diào)控的分子機(jī)制具有及其重要的意義。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn),在巨噬細(xì)胞內(nèi),孤兒核受體Nur77能被多種炎癥刺激誘導(dǎo)表達(dá),且在動(dòng)脈粥樣硬化早期和進(jìn)展期的病變內(nèi)Nur77呈較高表達(dá),因此,Nur77可能是脂質(zhì)代謝,炎癥,動(dòng)脈粥樣硬化中重要的調(diào)控因子。然而,Nur77是如何

3、參與動(dòng)脈粥樣硬化的作用的,它的作用靶點(diǎn),信號通路,調(diào)控后的細(xì)胞生理機(jī)制均不清楚,進(jìn)一步闡明Nur77在動(dòng)脈粥樣硬化及其炎癥過程中的作用,將為動(dòng)脈粥樣硬化防治開辟新的思路。
　　 同時(shí)累積的證據(jù)表明,他汀類具有降低內(nèi)源性膽固醇以外的其他有益作用,如能抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞的增殖和活性,一系列臨床試驗(yàn)也證實(shí)了他汀類在冠心病的一級,二級預(yù)防中的有效作用。然而,他汀的抗炎的機(jī)制并不明確。
　　 在本課題中,我們以體外培養(yǎng)

4、的巨噬細(xì)胞為研究對象,并分別建立了穩(wěn)定表達(dá)Nur77,Nur77-△DBD(deltaDBD,缺失DNA結(jié)合區(qū)域)的細(xì)胞系,以oxLDL作為炎癥刺激,擬從oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥,凋亡的細(xì)胞模型中,探討孤兒核受體Nur77對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及存活的調(diào)控作用及潛在的機(jī)制,擬為設(shè)計(jì)和開發(fā)新的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物靶點(diǎn)提供初步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),探討了在oxLDL激活的巨噬細(xì)胞中,他汀類藥物對Nur77表達(dá)的影響及對炎癥的調(diào)控機(jī)制,為他

5、汀類藥物的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　 第一部分孤兒核受體Nur77對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控
　　 目的 oxLDL和巨噬細(xì)胞之間存在著交互式應(yīng)答,在動(dòng)脈粥樣硬化疾病的開始,進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。本研究探討了在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中,Nur77對炎癥反應(yīng)的調(diào)控及其機(jī)制。
　　 方法： RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng),以oxLDL作為炎癥刺激,用Real-time PCR和Western b

6、lotting技術(shù)檢測了Nur77表達(dá)；使用Western blotting方法檢測了MAPK信號通路；使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,G418篩選,建立了穩(wěn)定細(xì)胞系；siRNA技術(shù)knockdown Nur77表達(dá)；炎癥刺激后,Real-time PCR和Elisa法檢測炎癥因子的分泌；構(gòu)建了pGL3-COX-2啟動(dòng)子,定點(diǎn)突變方法構(gòu)建了啟動(dòng)子的突變體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測COX-2轉(zhuǎn)錄活性；Real-time PCR和Westernblott

7、ing方法檢測COX-2表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)oxLDL作為炎癥刺激,可以誘導(dǎo)Nur77mRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào)；(2)p38 MAPK信號通路抑制劑抑制了Nur77表達(dá)上調(diào)；(3)過表達(dá)Nur77,抑制了炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和腫瘤壞死因子(TNF)α的分泌,而Nur77-ADBD沒有抑制作用;(4)siRNAknockdown Nur77表達(dá)后,炎癥因子的分泌增加；(5)6-巰基嘌呤(6-MP)預(yù)處理細(xì)

8、胞后,減少了炎癥因子的分泌；(6)Nur77與pGL3-COX-2啟動(dòng)子共轉(zhuǎn),抑制了COX-2的轉(zhuǎn)錄活性；而Nur77-△DBD沒有抑制作用；Nur77與啟動(dòng)子突變體共轉(zhuǎn),也沒有抑制作用；(7)過表達(dá)Nur77抑制了COX-2 mRNA和蛋白水平表達(dá)；(8)siRNAknockdown Nur77表達(dá)后,COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)增加；(9)6-MP預(yù)處理細(xì)胞后,抑制了COX-2的表達(dá)
　　 結(jié)論：(1)oxLDL可以誘導(dǎo)N

9、ur77表達(dá),p38 MAPK信號通路參與了此過程的調(diào)控；(2)在激活的巨噬細(xì)胞中,Nur77通過抑制COX-2表達(dá)減少炎癥因子的分泌。
　　 第二部分孤兒核受體Nur77對巨噬細(xì)胞存活的調(diào)控
　　 目的oxLDL是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的一個(gè)重要的誘導(dǎo)劑,高劑量oxLDL可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,斑塊破裂。本研究中,探討在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡中Nur77調(diào)控作用及其潛在機(jī)制。
　　 方法： MTT方法測定細(xì)胞活力

10、；oxLDL刺激細(xì)胞,用Western blotting方法檢測了MAPK信號通路；將細(xì)胞分為未刺激組,p38 MAPK通路抑制劑SB203580處理組,oxLDL刺激組,聯(lián)合刺激組,MTT方法測定細(xì)胞活力；Real-time PCR方法檢測了細(xì)胞周期相關(guān)的基因；流式細(xì)胞儀AnexinV法染色檢測細(xì)胞凋亡；細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)Nur77,炎癥刺激,BrdU Elisa方法檢測DNA合成；Real-time PCR方法檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因PCN

11、A,p21及凋亡相關(guān)基因Caspase3的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)巨噬細(xì)胞隨著oxLDL刺激濃度增加,細(xì)胞活力下降；(2)使用p38通路抑制劑SB203580預(yù)處理后,細(xì)胞活力下降,細(xì)胞增殖周期相關(guān)基因CyclinA2,PCNA表達(dá)下降,流式細(xì)胞儀證實(shí)了細(xì)胞凋亡比例增加；(3)過表達(dá)Nur77,細(xì)胞活力不下降,不影響DNA合成；(4)oxLDL刺激細(xì)胞后,細(xì)胞增殖周期相關(guān)基因PCNA表達(dá)下降,細(xì)胞周期抑制基因p21表達(dá)上調(diào),而

12、過表達(dá)Nur77細(xì)胞周期基因未見明顯變化；(5)過表達(dá)Nur77抑制凋亡基因Caspase3的表達(dá)。(6)siRNA knockdown Nur77表達(dá)后,明顯上調(diào)Caspase3基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論：(1)Nur77在oxLDL刺激下可以被激活,p38 MAPK信號通路參與這一表達(dá)過程的調(diào)控,同時(shí)參與了細(xì)胞存活的調(diào)控。(2)Nur77參與了細(xì)胞周期相關(guān)的基因調(diào)控,抑制凋亡基因的表達(dá),起到了促細(xì)胞存活的作用。
　　

13、第三部分阿托伐他汀對巨噬細(xì)胞炎癥調(diào)控機(jī)制中Nur77的作用
　　 目的：動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。累積的證據(jù)表明他汀類在降低膽固醇以外,還具有調(diào)控炎癥的作用。本研究探討了在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中,阿托伐他汀對炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制中Nur77的作用。
　　 方法：oxLDL刺激細(xì)胞后,Real-time PCR方法檢測了COX-2 mRNA表達(dá)；Western blotting方法檢測了COX-2蛋白表達(dá)；用不同濃

14、度的阿托伐他汀預(yù)處理細(xì)胞后,給予或不給予oxLDL刺激,Westernblotting方法檢測了Nur77表達(dá)；Real-time PCR及Western blotting方法分別檢測了COX-2 mRNA及蛋白的表達(dá)；Western blotting方法檢測了ERK1/2 MAPK信號通路及IκBa表達(dá)；使用ERK1/2通路抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后,分別用Real-time PCR和Western blotting方法檢測CO

15、X-2表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)oxLDL刺激細(xì)胞后,上調(diào)了COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)；(2)給予不同濃度的阿托伐他汀預(yù)處理細(xì)胞后,Nur77表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)(3)給予不同濃度的阿托伐他汀預(yù)處理細(xì)胞后,抑制了COX-2mRNA和蛋白表達(dá)；(3)給予不同濃度的阿托伐他汀預(yù)處理細(xì)胞后,抑制了ERK1/2磷酸化,抑制了IκBa的降解；(4)給予PD98059預(yù)處理細(xì)胞后,抑制了COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)

16、論：(1)oxLDL呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)了COX-2表達(dá)。(2)阿托伐他汀呈劑量依賴性上調(diào)了Nur77蛋白表達(dá)。(3)阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制了oxLDL誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)。(3)其作用機(jī)制是通過上調(diào)Nur77表達(dá)及抑制了ERK1/2的磷酸化和IκBa的降解。
　　 總結(jié)：本研究以巨噬細(xì)胞為研究對象,對Nur77在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和存活以及他汀在巨噬細(xì)胞炎癥中的調(diào)控及其分子機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nur77在oxLDL炎癥刺激下

17、通過p38 MAPK信號通路被誘導(dǎo)表達(dá)；并參與激活的巨噬細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)；機(jī)制研究表明Nur77通過抑制COX-2表達(dá)負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)。Nur77參與oxLDL誘導(dǎo)凋亡的巨噬細(xì)胞中細(xì)胞存活的調(diào)控；機(jī)制研究表明Nur77參與了細(xì)胞周期相關(guān)的基因調(diào)控,抑制凋亡基因的表達(dá),起到了促細(xì)胞存活的保護(hù)作用。阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制了oxLDL誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)；其作用機(jī)制是通過上調(diào)Nur77表達(dá)及抑制ERK1/2的磷酸化和IκBa的降解。本