FIZZ1在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)，主要圍繞4種學(xué)說(shuō)：脂肪浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血小板聚集和血栓形成學(xué)說(shuō)、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說(shuō)和損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)，但至今詳細(xì)發(fā)病機(jī)理仍未完全闡明。近年來(lái)不少研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化的病理表現(xiàn)具有炎癥病理的基本表現(xiàn)形式：變質(zhì)、滲出和增生，其形成過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)類似類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性胰腺炎和肝硬化等慢性炎癥性疾病的細(xì)胞間相互作用，隨著炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的不斷檢

2、出，動(dòng)脈粥樣硬化不再被認(rèn)為是單純的動(dòng)脈壁脂質(zhì)堆積的疾病，而是進(jìn)展性炎癥反應(yīng)，符合炎癥表現(xiàn)的普遍規(guī)律。目前，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)現(xiàn)的促炎因子較多，如血小板源性生長(zhǎng)因子β(PDGF-β)、血小板衍生因子(PDEF)、單核細(xì)胞趨化蛋白1、白細(xì)胞介素3、環(huán)氧合酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶、去組合蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白等，由于目前臨床針對(duì)上述介質(zhì)的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物起效緩慢且療效有待提高，因此是否還有其它炎癥因子參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展有待進(jìn)一步研究。FIZZ1

3、(Found in Inflammatory Zone 1)是2000年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與炎癥相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子，是運(yùn)用表達(dá)序列標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)掃描的方法發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，分子量9.4KD，具有刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、收縮血管、促進(jìn)血管新生、刺激肌纖維母細(xì)胞分化等功能，在脂肪組織的間質(zhì)血管以及選擇性激活的巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)，缺氧的肺血管壁也有表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)性肺纖維化、哮喘、過(guò)敏性肺炎、寄生蟲感染等疾病中具有重要意義，其在動(dòng)脈粥樣硬化中

4、是否表達(dá)則為未知，由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)存在Th2型細(xì)胞因子以及大量激活的巨噬細(xì)胞，動(dòng)脈粥樣硬化的血管壁也存在缺氧，因此，我們推測(cè)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可能有FIZZ1表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)FIZZ1表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)FIZZ1mRNA表達(dá)，并探討FIZZ1對(duì)體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞增殖，平滑肌細(xì)胞清道夫受體SR-A，巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)影響，同時(shí)探討降脂治療對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊FIZZ1表達(dá)的影響。

5、研究方法 本研究分三部分，第一部分：選取C57BL/6J ApoE基因敲除鼠及C57BL/6J野生型小鼠，分別喂食高脂飼料及普通飼料，24周后處死小鼠，石蠟包埋血管后作連續(xù)切片，行HE染色及FIZZ1免疫組化染色，檢測(cè)斑塊FIZZ1表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)FIZZ1mRNA表達(dá)，然后，模擬粥樣斑塊內(nèi)細(xì)胞因子環(huán)境，用Th2型細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，RT-PCR以及激光共聚焦顯微鏡觀察刺激后細(xì)胞

6、FIZZ1mRNA及其蛋白表達(dá)情況，初步鑒定粥樣斑塊內(nèi)分泌FIZZ1的可能的細(xì)胞；第二部分用終濃度分別為3×10<'-6>mmol/L，9×10<'-6>mmol/L，2.7×10<'-5>mmol/L的FIZZ1刺激培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞，<'3>H摻入法以及MTT法測(cè)定FIZZ1對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響；用ox-LDL以及終濃度分別為3×10<'-6>mmol/L，9×10<'-6>mmol/L，2.7×10<'-5>mmol/L的FIZZ

7、1刺激培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)確認(rèn)SR-A表達(dá)后，激光共聚焦顯微鏡對(duì)SR-A表達(dá)進(jìn)行定位，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FIZZ1對(duì)平滑肌細(xì)胞SR-A及其巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)的影響，評(píng)價(jià)FIZZ1能否影響動(dòng)脈粥樣硬化吞噬脂質(zhì)的關(guān)鍵受體。第三部分：制作動(dòng)脈粥樣硬化以及高脂血癥動(dòng)物模型，然后用辛伐他汀干預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，21周后，用免疫組化方法檢測(cè)粥樣斑塊FIZZ1蛋白表達(dá)情況，RT-PCR方法檢測(cè)FIZZ1mRNA表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形

8、態(tài)及其血脂水平，探討調(diào)脂治療對(duì)FIZZ1表達(dá)的影響。 結(jié)果 1．ApoE基因敲除鼠高脂飼養(yǎng)24周后，主動(dòng)脈根部明顯形成動(dòng)脈粥樣硬化，斑塊體積大，免疫組化可見(jiàn)FIZZ1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)明顯表達(dá)，RT-PCR可見(jiàn)FIZZ1mRNA表達(dá)，同齡野生型C57BL/6J鼠正常血管壁內(nèi)，未見(jiàn)FIZZ1表達(dá)，Th2型細(xì)胞因子能刺激培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞表達(dá)FIZZ1，但不能刺激體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞表達(dá)FIZZ1。 2．MTT檢測(cè)平滑

9、肌細(xì)胞增殖提示，F(xiàn)IZZ1 3×10<'-6>mmol/L組與對(duì)照組吸光度值比較，明顯升高，P<0.05，差異有顯著性；FIZZ1 9×10<'-6>mmol/L，組與FIZZ1 3×10<'-6>mmol/L組比較，吸光度值明顯升高，差異有顯著性，P<0.05，F(xiàn)IZZ1 2.7×10<'-5>mmol/L組與9×10<'-6>mmol/L組比較，吸光度值明顯升高，差異有顯著性，說(shuō)明FIZZ1能刺激平滑肌細(xì)胞增殖。<'3>H-TdR摻

10、入法檢測(cè)也提示：FIZZ1刺激平滑肌細(xì)胞增殖。 3．激光共聚焦顯微鏡可見(jiàn)在ox-LDL刺激24小時(shí)的平滑肌細(xì)胞，有SR-A表達(dá)，主要位于細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)ox-LDL能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞SR-A表達(dá)。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示，F(xiàn)IZZ1 3×10<'-6>mmol/L組與對(duì)照組SR-A表達(dá)陽(yáng)性率比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異(P<0.01)；FIZZ1 9×10<'-6>mmol/L組與FIZZ1 3×10<'-6>m

11、mol/L組SR-A表達(dá)陽(yáng)性率比較，有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)IZZ1 2.7×10<'-5>mmol/L組與9×10<'-6>mmol/L組SR-A表達(dá)陽(yáng)性率比較，有極顯著性差異(P<0.01)，說(shuō)明FIZZ1能明顯促進(jìn)ox-LDL刺激的平滑肌細(xì)胞SR-A表達(dá)。 5．ox-LDL明顯刺激巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)，F(xiàn)IZZ1不影響體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36的表達(dá)，說(shuō)明FIZZ1不能通過(guò)影響巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)來(lái)影響

12、巨噬細(xì)胞ox0-LDL的攝取，影響動(dòng)脈粥樣硬化。 6．Apoe基因敲除鼠高脂飼養(yǎng)21周后，主動(dòng)脈根部明顯形成動(dòng)脈粥樣硬化，血脂代謝明顯紊亂，免疫組化可見(jiàn)FIZZ1在粥樣硬化斑塊內(nèi)明顯表達(dá)，辛伐他汀能降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)FIZZ1mRNA及其蛋白表達(dá)(與對(duì)照組比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)。 結(jié)論 1．FIZZ1在ApoE基因敲除鼠粥樣斑塊內(nèi)明顯表達(dá)，同齡野生型C57BL/6J鼠血管壁內(nèi)，F(xiàn)IZZ1不表

13、達(dá)，F(xiàn)IZZ1可能為一種新的影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的促炎因子。 2．Th2型細(xì)胞因子可以刺激巨噬細(xì)胞FIZZ1表達(dá)，但不能刺激平滑肌細(xì)胞FIZZ1表達(dá)，Th2型細(xì)胞因子刺激巨噬細(xì)胞可能為斑塊內(nèi)FIZZ1表達(dá)機(jī)理之一。 3．FIZZ1明顯刺激體外培養(yǎng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。 4．FIZZ1不影響體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36的表達(dá)，F(xiàn)IZZ1能促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞SR-A表達(dá)，從而可能加速