TNFAIP8L1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)與血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化還原狀態(tài)間的失衡會(huì)導(dǎo)致血管細(xì)胞功能失調(diào)，作為MAPK家族成員的Erks、JNKs和P38 MAPK在ROS誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)中起重要的協(xié)調(diào)作用。PI3K/Akt信號(hào)通路、FoxO3a及NF-κB信號(hào)通路在氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中也起到重要作用。
　　TIPE1(TNFAIP8L1,TNF-α-induced protein8-like1)與TIPE(TNFAI

2、P8)、TIPE2(TNFAIP8L2)、TIPE3(TNFAIP8L3)同為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8家族(tumor necrosis factor-alpha-induced protein8(TNFAIP8)family）成員，這四種成員間擁有大量的同源序列。TIPE是這個(gè)家族成員中首先被確認(rèn)的，含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域并且調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。雖然已有文章報(bào)道TIPE1蛋白廣泛表達(dá)于C57小鼠組織與細(xì)胞系中，但有關(guān)其功能研究的文章較少

3、，特別是TIPE1在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮為靶細(xì)胞，研究在氧化應(yīng)激時(shí)TIPE1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控作用，并以高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型觀察TIPE1的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生進(jìn)展中所起的作用，以期明確TIPE1在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用并揭示其分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究TIPE1在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　1.1

4、.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的獲取
　　取自齊魯醫(yī)院健康新生兒臍帶，無(wú)菌條件下分離獲取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，M199培養(yǎng)基加10％胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)，傳至第三至第十代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　1.2.氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TIPE1的影響
　　以不同濃度的H2O2刺激內(nèi)皮細(xì)胞，或者同一濃度刺激不同的時(shí)間，收集洗滌細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR或普通PCR，同時(shí)收集H2O2處理的細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行western b

5、lot檢測(cè)TIPE1表達(dá)狀況。
　　1.3.氧化應(yīng)激時(shí)TIPE1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　1.3.1.TIPE1過(guò)表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)生成ROS及抗氧化酶的影響
　　分別對(duì)轉(zhuǎn)染TIPE1表達(dá)質(zhì)粒pRK5-TIPE1及空載體pRK5轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，24小時(shí)后，以濃度為100μmol/L H2O2刺激細(xì)胞0、30min，收集細(xì)胞以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成情況并分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
　　H2O2分別

6、對(duì)轉(zhuǎn)染pRK5及pRK5-TIPE1的細(xì)胞刺激0、2h后，收集細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)抗氧化酶CAT、SOD2、GPx的基因表達(dá)情況，并收集H2O2刺激0、15、30 min的細(xì)胞，westem blot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a蛋白的活化情況。
　　1.3.2.TIPE1過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　運(yùn)用CCK-8的方法檢測(cè)在TIPE1過(guò)表達(dá)的情況下，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　1.3.3.TIPE

7、1過(guò)表達(dá)在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡的影響
　　TIPE1在過(guò)表達(dá)的情況下，用H2O2刺激細(xì)胞，分別用臺(tái)盼藍(lán)染色、AnnexinV/PI的方法檢測(cè)細(xì)胞的死亡情況，細(xì)胞周期分析TIPE1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期分布的影響，與轉(zhuǎn)染pRK5組對(duì)比分析結(jié)果，得出結(jié)論。此外，用western blot檢測(cè)促凋亡分子caspase3的活化、Bax的表達(dá)情況及抑凋亡分子Bcl2的表達(dá)情況。
　　1.3.4.TIPE1過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞攝取ox-L

8、DL的影響
　　在TIPE1過(guò)表達(dá)的情況下，用ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞，oil-red-O染色，檢測(cè)其對(duì)ox-LDL的攝取情況。
　　1.4.干擾TIPE1基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　轉(zhuǎn)染TIPE1小干擾RNA及無(wú)關(guān)對(duì)照序列，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，CCK-8檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的死亡。
　　1.5.TIPE1在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路的影響
　　在TIPE1過(guò)表達(dá)的情況下

9、，用H2O2刺激內(nèi)皮細(xì)胞，提取總蛋白，通過(guò)westernblot方法，檢測(cè)Akt、MAPK、IκB信號(hào)通路的活化情況。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　購(gòu)自北京科奧協(xié)力公司6-8w齡健康雄性ApoE-/-小鼠，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在高脂喂養(yǎng)一周后，分別對(duì)兩組注射TIPE1慢病毒和對(duì)照慢病毒。在高脂喂養(yǎng)8w后，處死小鼠，取其心臟主動(dòng)脈根部冰凍切片以進(jìn)行油紅O染色和HE染色，腹主動(dòng)脈以進(jìn)行大體油紅O染色，留取血清檢測(cè)脂蛋白水平。
　

10、　研究結(jié)果:
　　1.氧化應(yīng)激上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TIPE1
　　在H2O2刺激內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間后，無(wú)論其基因水平還是蛋白水平，H2O2都能促進(jìn)TIPE1的表達(dá)，呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　2.TIPE1促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生
　　因文獻(xiàn)報(bào)道H2O2可以直接引起氧化應(yīng)激并且產(chǎn)生過(guò)多的ROS，因此，在TIPE1過(guò)表達(dá)的情況下，用H2O2刺激細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成情況以確定TIPE1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的

11、ROS產(chǎn)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有H2O2刺激的情況下，TIPE1本身就可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生;H2O2刺激后，TIPE1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度大幅度提高。
　　3.TIPE1過(guò)表達(dá)抑制氧化應(yīng)激時(shí)抗氧化酶的表達(dá)
　　TIPE1過(guò)表達(dá)后，H2O2刺激內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)TIPE1有效的降低了CAT、SOD2、 GPx基因的表達(dá)，F(xiàn)oxO3a的磷酸化活化水平降低，說(shuō)明TIPE1過(guò)表達(dá)抑制氧化應(yīng)激時(shí)抗氧

12、化酶的表達(dá)。
　　4.TIPE1抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)
　　TIPE1過(guò)表達(dá)后，CCK-8方法檢測(cè)在H2O2刺激后不同時(shí)間其OD的變化情況，發(fā)現(xiàn)TIPE1本身可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而在H2O2刺激后，TIPE1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞其生長(zhǎng)增殖速度更低，由此可知，TIPE1在氧化應(yīng)激時(shí)抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　5.TIPE1過(guò)表達(dá)在氧化應(yīng)激時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的死亡
　　5.1.臺(tái)盼藍(lán)染色中TIPE1促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡
　　

13、TIPE1過(guò)表達(dá)后，H2O2刺激不同時(shí)間下用臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)TIPE1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞其死亡率明顯增加。
　　5.2.Annexin V/PI中TIPE1在氧化應(yīng)激時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡
　　TIPE1過(guò)表達(dá)后，H2O2刺激促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞Annexin V與PI雙染所占總細(xì)胞的比例，促凋亡分子caspase3的活化及Bax的表達(dá)均增高，而抗凋亡蛋白Bcl2的顯著降低，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞PI染色所表示的凋亡峰

14、所占各細(xì)胞周期的比例，這些結(jié)果提示TIPE1過(guò)表達(dá)促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡。
　　6.TIPE1過(guò)表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取
　　在TIPE1過(guò)表達(dá)的情況下，用ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞，油紅O染色，檢測(cè)其ox-LDL吸收情況。發(fā)現(xiàn)TIPE1過(guò)表達(dá)后促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取。
　　7.siRNA沉默TIPE1基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　在TIPE1基因沉默情況下，F(xiàn)CM檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平

15、明顯低于對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照細(xì)胞增快，細(xì)胞死亡明顯低于轉(zhuǎn)染對(duì)照無(wú)關(guān)序列的細(xì)胞，由此可進(jìn)一步說(shuō)明TIPE1能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡。
　　8.TIPE1在氧化應(yīng)激時(shí)通過(guò)調(diào)控Akt、MAPK、IκB信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的死亡
　　通過(guò)westem blot檢測(cè)H2O2刺激TIPE1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞其Akt、MAPK、IκB信號(hào)通路活化情況與對(duì)照組比較，可以發(fā)現(xiàn)TIPE1抑制p-Akt、p-IκB、p-Erk的活化而促進(jìn)

16、p-P38、p-JNK的活化，以此調(diào)控在氧化應(yīng)激時(shí)TIPE1所促進(jìn)的細(xì)胞死亡。
　　9.TIPE1蛋白促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生
　　通過(guò)對(duì)主動(dòng)脈根部冰凍切片進(jìn)行油紅O染色及HE染色，以及對(duì)腹主動(dòng)脈進(jìn)行大體油紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射高效表達(dá)TIPE1蛋白的慢病毒的小鼠體內(nèi)斑塊沉積情況明顯較注射對(duì)照慢病毒的小鼠嚴(yán)重，TIPE1對(duì)小鼠血糖、血清總膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的分泌沒(méi)有影響，而對(duì)甘油三酯和游離脂肪酸

17、的分泌起到促進(jìn)作用。提示TIPE1可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)TIPE1具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng);
　　2.TIPE1促動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制與TIPE1調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)，具體表現(xiàn)為:H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)上調(diào)TIPE1表達(dá)，且呈時(shí)間和劑量依賴性;表達(dá)的TIPE1蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取;