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文檔簡介
1、研究背景
c-Myc及E2F1相關(guān)信號途徑是決定細胞命運的核心機制之一,研究已證實hTERT是二者共同的下游靶基因,不同的是:c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達,而E2F1則抑制hTERT的表達。由于E2F1也受c-Myc正性調(diào)節(jié),因此,我們推測:在正常細胞中,E2F1可能對c-Myc-hTERT信號途徑存在著負反饋調(diào)控,從而在一定程度上抑制了腫瘤發(fā)生的危險性。
研究方法
本項目擬針對上述假設(shè),以人胚胎成纖維細胞
2、為模型,采用基因轉(zhuǎn)染、熒光素酶報告基因?qū)嶒灐HIP、CHIP-re-CHIP等技術(shù)證實E2F1對c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達的負反饋調(diào)節(jié)作用。
研究結(jié)果
1)c-Myc活化對人胚胎成纖維細胞hTERT和E2F1表達及下游信號通路的影響
以 Ad-c-Myc重組腺病毒感染人胚胎成纖維細胞,qRT-PCR及 Western blot檢測c-Myc活化對E2F1和hTERT mRNA及蛋白表達水平的影響。結(jié)果顯
3、示,E2F1和hTERT的表達在 c-Myc激活的情況下均會出現(xiàn)增加,二者區(qū)別在于,前者的表達水平是在c-Myc高度激活時才出現(xiàn)明顯增加,而后者的表達水平則可在c-Myc低度激活時就開始增加,而且c-Myc激活的程度越高,hTERT的表達水平增加越多,其表達水平的增加與c-Myc激活的程度是一致的。進一步,我們探討了c-Myc活化對E2F1和hTERT下游信號通路的影響,結(jié)果顯示,在c-Myc中低度時,端粒酶活性逐漸升高,而細胞凋亡的比
4、率并沒有明顯改變;在 c-Myc被高度激活的情況下,E2F1的蛋白表達水平出現(xiàn)明顯升高,這也就能夠增加細胞凋亡的比率。隨后對E2F1加以抑制,我們發(fā)現(xiàn):在c-Myc中低度激活時抑制E2F1表達,可致hTERT活化水平上升;而在c-Myc受到高度激活的同時對 E2F1的表達加以抑制,則能夠避免細胞凋亡,且細胞端粒酶的活性會出現(xiàn)有進一步的升高。以上這些結(jié)果顯示:E2F1對c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達是存在著負反饋調(diào)控作用的。
2)
5、E2F1通過與hTERT啟動子區(qū)域結(jié)合對c-Myc誘導(dǎo)hTERT表達進行負反饋調(diào)控我們首先應(yīng)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,在人胚胎成纖維細胞中 E2F1能夠抑制 hTERT基因表達,這個過程是可以通過 E2F1與 hTERT啟動子的結(jié)合而得以實現(xiàn)的;隨后應(yīng)用 CHIP實驗(anti-E2F1)進一步驗證 E2F1可與 hTERT啟動子區(qū)域直接結(jié)合;CHIP-re-CHIP實驗(anti-E2F1和anti-c-Myc)則顯示c-Myc活
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