E2F1調(diào)控microRNAs對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是全世界范圍內(nèi)致死率第六位的惡性腫瘤，可以分成兩種主要的類型，即食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌(esophagealadenocarcinoma，EA)，在中國(guó)主要的食管癌類型是食管鱗癌。近年來(lái)食管鱗癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，但其預(yù)后卻不樂(lè)觀，同時(shí)食管鱗癌的術(shù)后5年生存率居高不下。因此研究其發(fā)病機(jī)制，尋找早期診斷及治療的靶點(diǎn)顯得尤為重要。
　　作為DN

2、A損傷反應(yīng)重要的效應(yīng)原件之一，轉(zhuǎn)錄因子E2F1因?yàn)槟軌騾⑴c調(diào)控DNA損傷反應(yīng)過(guò)程中的細(xì)胞周期G1/S阻滯和細(xì)胞凋亡過(guò)程，近年來(lái)在DNA損傷反應(yīng)中的地位越來(lái)越突出。
　　E2F1是轉(zhuǎn)錄因子E2Fs家族中的一員，E2Fs是腫瘤抑制因子pRb的下游效應(yīng)因子，決定了眾多進(jìn)入并通過(guò)細(xì)胞周期S期基因的順序表達(dá)。深入探討E2F1在食管鱗癌中的功能及其具體機(jī)制具有重要的意義。
　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)度為2

3、1-23nt的非編碼小RNAs，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)。E2F1上調(diào)的miRNAs，可以反過(guò)來(lái)通過(guò)直接靶向或者間接抑制E2F1的表達(dá)作為E2F1通路的負(fù)反饋調(diào)控因子，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。此外，在DNA損傷反應(yīng)中，miRNAs既可以靶向調(diào)控DNA損傷反應(yīng)通路的相關(guān)基因ATM、ATR、Chk1，Chk2等，同時(shí)又可以被這些基因包括E2F1所轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在miR-203基因和miR-26b的主基因CTDSP

4、1的啟動(dòng)子區(qū)CpG島內(nèi)存在E2F1的結(jié)合位點(diǎn)，它們可能受到E2F1的調(diào)控。本課題旨在探討食管鱗癌細(xì)胞中E2F1調(diào)控miR-203和miR-26b表達(dá)的分子機(jī)制，以及他們?cè)谑彻荀[癌細(xì)胞生長(zhǎng)和DNA損傷反應(yīng)中的功能。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.順鉑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中miR-203的誘導(dǎo)作用依賴于E2F1的表達(dá)
　　1.1、采用Western blot和qRT-PCR的方法檢測(cè)順鉑作用于食管鱗癌細(xì)胞后，γ-

5、H2X和E2F1的表達(dá)，以及miR-203表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)和濃度梯度效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑處理食管鱗癌細(xì)胞EC109和Kyse450后，γ-H2X的表達(dá)增加，說(shuō)明發(fā)生了DNA損傷反應(yīng)。在E2F1蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，miR-203的表達(dá)也相應(yīng)升高。此外，順鉑對(duì)miR-203的誘導(dǎo)作用具有時(shí)間和濃度梯度效應(yīng)。研究結(jié)果提示miR-203在順鉑誘導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中表達(dá)增加，而這種表達(dá)效應(yīng)可能與E2F1的表達(dá)相關(guān)。
　　1.2、分

6、別采用Western blot和qRT-PCR的方法檢測(cè)在食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或者干擾E2F1的表達(dá)后，E2F1和miR-203的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在食管鱗癌細(xì)胞EC109和Kyse450中過(guò)表達(dá)E2F1后，miR-203表達(dá)增加。而干擾食管鱗癌細(xì)胞EC109和Kyse450中E2F1的表達(dá)后，在E2F1表達(dá)降低的同時(shí)，γ-H2X的表達(dá)降低，說(shuō)明順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)與E2F1的表達(dá)相關(guān)。更重要的是，E2F1的表達(dá)降低阻斷了順鉑

7、對(duì)miR-203的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果證明在食管鱗癌細(xì)胞中順鉑對(duì)miR-203的誘導(dǎo)作用是由E2F1介導(dǎo)的。
　　1.3、通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和ChIP實(shí)驗(yàn)研究E2F1對(duì)miR-203的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及相關(guān)機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)的方法，我們?cè)趍iR-203轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游發(fā)現(xiàn)三個(gè)潛在的E2F1結(jié)合位點(diǎn)，分別是-501/-486(BS1)、-439/-449(BS2)和-202/-194(BS3)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示過(guò)表達(dá)E2F1顯

8、著上調(diào)含有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因載體的轉(zhuǎn)錄活性，缺失BS2后，熒光素酶的結(jié)合活性幾乎完全消失。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E2F1與含有BS2的擴(kuò)增片段結(jié)合，而順鉑的處理又顯著增強(qiáng)了這種結(jié)合能力。這些結(jié)果證明了轉(zhuǎn)錄因子E2F1直接結(jié)合到miR-203基因的啟動(dòng)子區(qū)的BS2位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-203的表達(dá)水平。
　　2.miR-203對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　2.1、通過(guò)qRT-PCR和CCK8技術(shù)檢測(cè)miR-2

9、03在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)以及miR-203對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)對(duì)四種食管鱗癌細(xì)胞株中miR-203的基礎(chǔ)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)miR-203在EC109細(xì)胞中表達(dá)最低，在EC9706細(xì)胞中表達(dá)最高，過(guò)表達(dá)miR-203 mimics對(duì)EC109細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
　　2.2、通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和AnnexinⅤ-FITC技術(shù)檢測(cè)miR-203對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的作用。我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照NC相比，在E

10、C109細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-203能夠誘導(dǎo)細(xì)胞在G1期的顯著聚集，與此同時(shí)S期細(xì)胞比例顯著降低。相反，在EC9706細(xì)胞中阻斷miR-203的表達(dá)后，G1期細(xì)胞的比例顯著降低，而G2/M期和S期細(xì)胞顯著增加。結(jié)果提示miR-203可以抑制細(xì)胞周期G1/S期周期轉(zhuǎn)換。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-203對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡沒(méi)有影響。說(shuō)明miR-203對(duì)食管鱗癌生長(zhǎng)的抑制作用是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期而非細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。
　　2.3、通過(guò)Western

11、 blot技術(shù)檢測(cè)在食管鱗癌細(xì)胞EC109或者Kyse450中過(guò)表達(dá)miR-203mimics后CDK6、pRb和E2F1的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-203抑制了食管鱗癌細(xì)胞中CDK6、pRb和E2F1蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示可能miR-203通過(guò)抑制CDK6的表達(dá)作用于pRb蛋白，并最終使E2F1的表達(dá)降低。因此，食管鱗癌細(xì)胞中miR-203與E2F1之間可能通過(guò)CDK6形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)的環(huán)路。
　　3.順鉑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中m

12、iR-26b的誘導(dǎo)作用依賴于E2F1的表達(dá)
　　3.1、通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)采用不同濃度或者不同時(shí)間點(diǎn)的順鉑處理食管鱗癌細(xì)胞后，miR-26b的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑處理食管鱗癌細(xì)胞EC109和Kyse450后，miR-26b的表達(dá)升高，同時(shí)順鉑對(duì)miR-26b的誘導(dǎo)表達(dá)具有時(shí)間效應(yīng)和濃度梯度效應(yīng)。結(jié)合之前的結(jié)果——順鉑誘導(dǎo)EC109和Kyse450細(xì)胞中E2F1和γ-H2X的表達(dá)，提示miR-26b在順鉑誘導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞

13、DNA損傷反應(yīng)中表達(dá)增加，而這種表達(dá)效應(yīng)可能與E2F1的表達(dá)相關(guān)。
　　3.2、采用定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)E2F1后miR-26b的表達(dá);干擾食管鱗癌細(xì)胞中E2F1的表達(dá)后，加順鉑處理，檢測(cè)miR-26b的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞EC109和Kyse450中過(guò)表達(dá)E2F1后，miR-26b的表達(dá)升高;干擾這兩種細(xì)胞中E2F1的表達(dá)后，阻斷了順鉑對(duì)miR-26b的誘導(dǎo)作用。結(jié)果提示在食管鱗癌細(xì)胞中順鉑對(duì)m

14、iR-26b的誘導(dǎo)作用是由E2F1介導(dǎo)的。
　　4.miR-26b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　4.1、通過(guò)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-26b在33例食管鱗癌組織及其鄰近正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-26b在33例食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著低于臨近正常組織。
　　4.2、通過(guò)CCK8和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)miR-26b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b可以顯著抑制食管鱗癌EC109

15、細(xì)胞的生長(zhǎng)。在EC109細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-26b能夠誘導(dǎo)細(xì)胞在G1期的顯著聚集，相反在EC9706細(xì)胞中阻斷miR-26b的表達(dá)后，G1期細(xì)胞的比例顯著降低，結(jié)果提示miR-26b可以誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期G1/S期細(xì)胞阻滯。
　　4.3、運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)順鉑處理食管鱗癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期的變化;阻斷食管鱗癌細(xì)胞中miR-26b的表達(dá)后，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)采用順鉑處理食管鱗癌細(xì)胞Ky

16、se450后，G1期細(xì)胞比例都顯著增加，S期細(xì)胞比例顯著降低，而G2期細(xì)胞幾乎沒(méi)有變化。在Kyse450細(xì)胞中阻斷miR-26b的表達(dá)后，再加順鉑處理，G1期細(xì)胞比例沒(méi)有增加，反而降低。結(jié)果提示順鉑能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期G1/S期阻滯，而這種作用依賴于miR-26b的表達(dá)。
　　4.4、采用Western blot技術(shù)檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-26b后，Rb、ATM及E2F1的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR

17、-26b可以抑制ATM、Rb和E2F1的表達(dá)。結(jié)果提示ATM和Rb可能是miR-26b的靶基因，同時(shí)miR-26b可能通過(guò)Rb或者ATM作用于E2F1的表達(dá)，形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示在食管鱗癌細(xì)胞中E2F1能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-203和miR-26b的表達(dá)，反過(guò)來(lái)，miR-203和miR-26b又分別通過(guò)不同的下游基因反作用于E2F1，提示miR-203和miR-26b為E2F1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新成員。