配對(duì)盒基因2(PAX2)對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、食管鱗癌組織中PAX2因子的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：研究配對(duì)基因盒2（PAX2）在食管鱗癌(ESCC)組織、癌旁組織及正常食管上皮組織中的表達(dá)。
　　方法：通過(guò)免疫組織化學(xué)熒光染色方法檢測(cè)15例正常食管組織、52例食管鱗癌癌旁組織和120例食管鱗癌組織中PAX2的蛋白表達(dá)水平，并觀察其與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及淋巴管浸潤(rùn)的關(guān)系。
　　結(jié)果：在人食管鱗癌組織中PAX2蛋

2、白表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織及正常食管組織（P=0.003和P=0.002）。PAX2蛋白表達(dá)水平與TNM分期相關(guān)（P=0.001），PAX2表達(dá)水平在37例TNM III和IV期患者中明顯高于67例I和II期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.353±0.088和1.933±0.133，P<0.0001）；同樣，PAX2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.019）和淋巴管浸潤(rùn)（P=0.005）相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而PAX2的表達(dá)與患者年齡、性別

3、、生物學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論：PAX2在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織及正常食管組織，且與TNM分期、淋巴結(jié)或轉(zhuǎn)移及淋巴管浸潤(rùn)具有顯著相關(guān)性。
　　第二部分、PAX2在食管癌中的生物學(xué)功能研究
　　目的：研究配對(duì)基因盒2（PAX2）在食管鱗癌細(xì)胞株TE-1和Eca-109細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　方法：構(gòu)建 PAX2過(guò)表達(dá)載體并驗(yàn)證上述載體和靶向PAX2的siRNA。通過(guò)MTT與克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

4、PAX2對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響；通過(guò)Transwell小室模型檢測(cè)PAX2對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響；通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAX2對(duì)放射敏感性的影響；通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)。
　　結(jié)果：食管癌TE-1和Eca-109細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAX2過(guò)表達(dá)載體后，細(xì)胞中PAX2蛋白水平明顯提高；細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向PAX2的siRNA后，PAX2的水平顯著低于對(duì)照組。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)表明：PAX2過(guò)表達(dá)會(huì)抑制細(xì)

5、胞的生長(zhǎng)及克隆形成；而敲低PAX2的表達(dá)則能加速細(xì)胞的生長(zhǎng)與克隆形成。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，PAX2過(guò)表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲，敲低PAX2水平則抑制細(xì)胞的侵襲。PAX2過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)MMP2和MMP9的表達(dá)水平。抑制PAX2的表達(dá)可提高食管癌細(xì)胞的放射敏感性。
　　結(jié)論：PAX2具有抑制食管癌增殖、促進(jìn)食管癌侵襲及放射抗拒性的功能。
　　第三部分、PAX2在食管癌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究
　　目的：研究配對(duì)基因盒2（

6、PAX2）在食管癌細(xì)胞株中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及下游靶基因，全面揭示PAX2的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　方法：TE-1細(xì)胞過(guò)表達(dá)PAX2后采用表達(dá)譜芯片檢測(cè)與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體的細(xì)胞mRNA表達(dá)譜的變化?？寺〔煌L(zhǎng)度的白介素5（IL-5）基因的啟動(dòng)子到pGL3-Basic報(bào)告基因載體上。采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAX2對(duì)IL-5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。采用RT-PCR檢測(cè)PAX2對(duì)內(nèi)源性IL-5的轉(zhuǎn)錄激活作用。采用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）檢測(cè)PAX2與IL-

7、5啟動(dòng)子DNA的直接結(jié)合。在組織樣品中檢測(cè)PAX2與IL-5 mRNA的相關(guān)性。
　　結(jié)果：食管癌TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAX2過(guò)表達(dá)載體后有數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化（變化倍數(shù)大于等于2倍）。生物信息學(xué)表明，上調(diào)變化倍數(shù)較大IL-5基因的啟動(dòng)子上游-110到-1100bp處存在兩個(gè)PAX2結(jié)合位點(diǎn)，提示PAX2可能直接調(diào)控IL-5的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明IL-5啟動(dòng)子缺失PAX2的結(jié)合位點(diǎn)后熒光素酶活性顯著下降；PAX2過(guò)表