TIM-3在人食管癌組織中的表達及其對食管癌細胞生物學特性的影響和作用機制的研究.pdf

1、目的：本文旨在通過檢測 T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（ T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein3，TIM-3）在人食管鱗癌（全稱ESCC）組織及相應癌旁正常組織中的表達變化，分析其與患者臨床病理特征及術后生存時間之間的關系。通過靶向沉默 TIM-3分子的表達，研究 TIM-3對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及周期分布的生物學特性的影響，并進一步探討 TIM-3促

2、進食管癌細胞侵襲轉移的作用機制。
　　方法：
　　1采用實時熒光定量PCR（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法檢測人食管癌組織及相應癌旁正常組織中TIM-3 mRNA的表達水平。
　　2采用免疫組織化學方法檢測人食管癌組織及相應癌旁正常組織中TIM-3蛋白的表達水平，并分析其表達與患者臨床病理特征及預后的關系。

3、　　3采用免疫組織化學方法檢測人食管癌組織中 CD8+T細胞的浸潤程度，并分析食管癌組織中TIM-3的表達水平與CD8+T細胞浸潤程度的相關性。
　　4采用 qRT-PCR和 Western blotting方法分別檢測人食管癌細胞系Eca109、TE-1、TE-13、KYSE30和KYSE170中TIM-3 mRNA及蛋白的表達情況。
　　5構建沉默 TIM-3的真核表達載體（psi-U6-TIM-3），轉染食管癌Eca1

4、09和TE-1細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選2周，挑取單克隆擴大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定敲低TIM-3表達的Eca109-shTIM-3和TE-1-shTIM-3細胞及各自陰性對照Eca109-NC和TE-1-NC細胞。采用流式細胞技術檢測TIM-3shRNA的轉染效率；采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測下調TIM-3表達的有效性。
　　6采用MTS法和平板克隆形成實驗檢測敲低TIM-3基因表達對食管癌細胞增殖能力的影響。<

5、br>　　7采用劃痕愈合實驗和Transwell遷移實驗檢測敲低TIM-3基因表達對食管癌細胞遷移能力的影響。
　　8采用 Matrigel侵襲實驗檢測敲低 TIM-3基因表達對食管癌細胞侵襲能力的影響。
　　9采用流式細胞技術檢測敲低 TIM-3基因表達對食管癌細胞凋亡及周期分布的影響。
　　10采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測敲低TIM-3基因表達對食管癌細胞轉移相關分子（MMP-9，T

6、IMP-1，E-cadherin，N-cadherin， Vimentin）表達水平的影響。
　　11采用Western blotting方法檢測敲低TIM-3基因表達對食管癌細胞Akt/GSK-3β/Snail信號通路的影響。
　　結果：
　　1 qRT-PCR檢測結果顯示，40例食管癌組織中TIM-3 mRNA的表達水平顯著高于相應癌旁正常組織（0.002±0.0007 vs.0.001±0.0004），差異具有統(tǒng)

7、計學意義（P＜0.001）。
　　2免疫組織化學分析結果顯示，TIM-3蛋白主要定位于食管癌細胞的胞漿和胞膜。64例食管癌組織中，TIM-3蛋白陽性（得分＞1）表達率為85.9％（55/64）；相應癌旁正常組織中，TIM-3蛋白陽性表達率為10.9%（7/64）。55例 TIM-3陽性食管癌組織中，19例（34.5%）顯示 TIM-3低表達（得分≤3），36例（65.5%）顯示TIM-3高表達（得分＞3）；然而，7例TIM-3陽性

8、癌旁正常組織均顯示TIM-3低表達。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中 TIM-3蛋白的表達水平明顯高于相應癌旁正常組織（P＜0.001）。食管癌組織中 TIM-3蛋白的表達水平與患者 TNM分期（P＝0.008）、淋巴結轉移（P＝0.042）及腫瘤浸潤深度（P＝0.042）密切相關，而與患者性別、年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，TIM-3高表達組患者的總體生存率明顯低于低表達組患者，差異具有統(tǒng)計

9、學意義（P＝0.001）。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，TIM-3高表達組患者的5年生存率為9%，中位生存時間為22個月；TIM-3低表達組患者的5年生存率為19.2%，中位生存時間為41個月。
　　3免疫組化染色結果顯示，64例食管癌組織中，CD8+T細胞低度浸潤25例，高度浸潤39例。Spearman相關性分析顯示，64例食管癌組織中，TIM-3的表達水平與CD8+T細胞浸潤程度呈負相關（P＝0.008）。
　　4 qRT-PCR檢測

10、結果顯示， TIM-3 mRNA在5種食管癌細胞系Eca109、TE-1、TE-13、KYSE30和 KYSE170中均有不同程度的組成性表達。其中，TIM-3 mRNA在Eca109和TE-1細胞系中的表達量相對較高。Western blotting檢測結果顯示，與TIM-3 mRNA表達情況一致，TIM-3蛋白在Eca109和TE-1細胞系中的表達量相對較高。
　　5為了研究TIM-3對食管癌細胞生物學特性的影響，選擇TIM-

11、3表達量相對較高的Eca109和TE-1細胞系敲低TIM-3的表達。流式細胞技術分析結果顯示，Eca109-shTIM-3和Eca109-NC細胞的轉染效率分別為91.5%和93.2%；TE-1-shTIM-3和TE-1-NC細胞的轉染效率分別為85.3%和87.7%。qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，Eca109-shTIM-3細胞中 TIM-3的表達水平明顯低于空轉染 Eca109-NC細胞及未轉染Eca

12、109細胞（P＜0.001）。同樣，TE-1-shTIM-3細胞中 TIM-3的表達水平明顯低于空轉染TE-1-NC細胞及未轉染TE-1細胞（P＜0.001）。以上結果說明，通過穩(wěn)定轉染TIM-3shRNA可有效下調Eca109和TE-1細胞中TIM-3的表達。
　　6 MTS檢測結果顯示，接種于96孔板24、48、72h后，轉染TIM-3shRNA的Eca109和TE-1細胞的吸光度值均明顯低于各自空轉染組及未轉染組（P＜0.0

13、1）；平板克隆形成實驗結果顯示，與各自空轉染組及未轉染組細胞相比，轉染TIM-3shRNA后Eca109和TE-1細胞的克隆形成能力均顯著降低（P＜0.001）。
　　7劃痕愈合實驗結果顯示，與各自空轉染組及未轉染組細胞相比，劃痕24、48h后轉染TIM-3shRNA的Eca109和TE-1細胞向劃痕邊緣的爬行速度明顯減慢，劃痕缺損修復緩慢，劃痕間距相對較寬，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Transwell遷移實驗結果顯示

14、，與各自空轉染組及未轉染組細胞相比，轉染TIM-3shRNA后Eca109和TE-1細胞穿過基底膜的數(shù)量均顯著降低（P＜0.001）。
　　8 Matrigel侵襲實驗結果顯示，與各自空轉染組及未轉染組細胞相比，轉染TIM-3shRNA后Eca109和TE-1細胞穿過基底膜的數(shù)量均顯著降低（P＜0.001）。
　　9流式細胞技術檢測細胞凋亡結果顯示，與各自空轉染組及未轉染組細胞相比，轉染TIM-3shRNA后Eca109和T

15、E-1細胞的凋亡率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；流式細胞技術檢測細胞周期分布結果顯示，與各自空轉染組及未轉染組細胞相比，轉染TIM-3shRNA后Eca109和TE-1細胞的G0/G1期細胞比例均顯著增加（P＜0.001），S期細胞比例均顯著下降（P＜0.001）。
　　10 qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，敲低TIM-3基因表達能夠顯著下調Eca109和TE-1細胞中MMP-9、N-cadhe

16、rin和Vimentin基因及蛋白的表達水平，上調TIMP-1和E-cadherin基因及蛋白的表達水平（P＜0.001）。
　　11 Western blotting檢測結果顯示，敲低TIM-3基因表達能夠顯著下調Eca109和TE-1細胞中p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser9）和EMT相關轉錄因子Snail的表達水平（P＜0.001），但不影響總Akt和總 GSK-3β的表達水平（P＞0.05）。
　　

17、結論：
　　1 TIM-3在人食管癌組織中異常高表達，且與腫瘤進展及患者不良預后密切相關，有望成為食管癌患者新的治療靶點和預后標記。
　　2 TIM-3在人食管癌組織中的表達與 CD8+T細胞浸潤程度呈負相關，提示TIM-3可能參與食管癌的免疫逃逸。
　　3敲低TIM-3基因表達可使食管癌細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制食管癌細胞的增殖能力。
　　4 TIM-3至少部分通過Akt/GSK-3β/Snail信號