食管神經(jīng)和遞質(zhì)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖與分化的作用及其機(jī)制.pdf

1、1.研究背景 河南林州(原林縣)及其毗鄰的地區(qū)是世界上食管癌(esophagaeal cancer,EC)發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)，而且，EC當(dāng)前仍是該地區(qū)腫瘤相關(guān)疾病的主要死亡原因。但是，目前食管癌變的分子機(jī)制仍不十分清楚。最近有文獻(xiàn)報(bào)道食管癌的發(fā)生發(fā)展與個(gè)體的心理應(yīng)激、神經(jīng)免疫因素等密切相關(guān)。 本研究認(rèn)為食管癌變及其演進(jìn)是通過(guò)多因素、多階段、多基因的作用，且具有復(fù)雜的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室多年的研究也提示多個(gè)抑癌基因和癌基因

2、以及蛋白質(zhì)的功能紊亂是導(dǎo)致食管癌變始動(dòng)的原因，但尚未能發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的基因與蛋白分子。食管癌變的好發(fā)部位為食管中下段，食管癌前病變并具有雙向發(fā)展的不穩(wěn)定特性，提示食管癌變具有可逆性。另有研究發(fā)現(xiàn)激活腦干5-HT中縫核一迷走神經(jīng)通路對(duì)內(nèi)臟具有保護(hù)作用，表明中縫核5-HT神經(jīng)元通過(guò)釋放5-HT調(diào)節(jié)著迷走神經(jīng)的功能。有關(guān)心理應(yīng)激(Stress)的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的心理壓力或抑郁可導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT及其受體水平降低，提示應(yīng)激可影響迷走神經(jīng)至食管的膽堿能功

3、能下降，進(jìn)而推測(cè)食管病理變化可能與迷走神經(jīng)至食管神經(jīng)通路的結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān)，而且食管神經(jīng)功能異常在食管癌變與食管癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中占有重要地位。近年的研究提示，EC細(xì)胞角質(zhì)蛋白(Keratin)、氧化還原酶(PRX1)、鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白(Annexin-2)表達(dá)異常。Keratin 5和Keratin 20分別為上皮祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞的標(biāo)志，也是上皮細(xì)胞起黏附、支持和保護(hù)的功能基礎(chǔ)。PRXl對(duì)細(xì)胞DNA損傷具有修復(fù)作用。Annexin-

4、2具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞增殖的作用等，可能是抑制食管癌變的重要分子之一。AChR和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CHAT)是ACh作用于細(xì)胞的傳遞分子。微管相關(guān)蛋白(MAF2)是神經(jīng)元的骨架連接蛋白，退行性變的神經(jīng)元及神經(jīng)纖維表達(dá)減少。上述分子為進(jìn)一步研究提供了重要的線索和觀察的指標(biāo)。 因此，本研究采用組織切片、HE染色、免疫熒光、免疫組化染色等方法對(duì)食管癌壁間神經(jīng)叢的形態(tài)與食管癌細(xì)胞功能基因與蛋白表達(dá)變化進(jìn)行觀察，對(duì)其與食管癌變和癌細(xì)

5、胞轉(zhuǎn)化的關(guān)系予以分析。并進(jìn)一步采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法、免疫熒光與免疫組化染色、流式細(xì)胞以及RT-PCR技術(shù)等探討交感和副交感神經(jīng)及其遞質(zhì)NE與ACh對(duì)食管癌細(xì)胞抑癌基因和功能蛋白表達(dá)變化的影響，分析ACh與NE對(duì)食管癌變與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，旨在揭示與闡明食管神經(jīng)及其遞質(zhì)變化在食管癌變中的作用和意義，并為食管癌的靶向防治提供新的研究思路。 2.材料與方法 2．1 EC壁間神經(jīng)形態(tài)與癌細(xì)胞功能蛋白表達(dá)變化關(guān)系的觀察 42

6、例食管癌標(biāo)本均來(lái)自河南省林州市中心醫(yī)院和姚村食管癌醫(yī)院，男性37例，女性5例，其平均年齡為60.3±6.5。所有患者在術(shù)前均未接受任何化療或放療。經(jīng)4％的多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，采用免疫熒光、免疫組化ABC法，對(duì)癌、癌旁和正常組織進(jìn)行免疫組化染色，觀察與分析癌、癌旁和正常組織壁間神經(jīng)形態(tài)與癌細(xì)胞．AChR、ChAT、Annexin-2、PRXl、MAP2、Keratin5和Keratin20表達(dá)變化之間以及各功能蛋白表達(dá)變化相

7、互之間的關(guān)系，以了解食管神經(jīng)在食管癌變過(guò)程中的作用及其變化特點(diǎn)。 2．2體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞培養(yǎng)法，并借助細(xì)胞受體阻斷劑(阿托品、托拉唑林)、細(xì)胞外基質(zhì)阻斷劑(U0126)對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞(鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究室所保存食管鱗癌細(xì)胞株)進(jìn)行體外培養(yǎng)，應(yīng)用免疫組化、免疫熒光、MTT、平板細(xì)胞克隆、流式細(xì)胞、熒光定量RT-PCR等技術(shù)方法，觀察ACh、NE處理前后EC97061細(xì)胞的AChR、ChAT、

8、Annexin-2、Keratin 5和Keratin 20等表達(dá)以及細(xì)胞增殖周期與增殖活力的變化，分析ACh、NE以及細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和分化的影響與相互關(guān)系，以揭示神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)食管癌變、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及其可能性分子機(jī)制。 2．3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，選用單因素方差分析和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)資料用x±s表示，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05表示差異有顯著意義，P<0.01

9、表示差異有非常顯著意義。 3 結(jié)果 3．1食管壁間神經(jīng)形態(tài)與功能蛋白表達(dá)的變化及其關(guān)系食管壁間神經(jīng)MAP2陽(yáng)性強(qiáng)度由正常到增生、原位癌、癌逐漸減淡，細(xì)纖維減少至喪失。AChR、ChAT、Annexin-2、PRX1、K20表達(dá)隨癌變演進(jìn)和食管壁間神經(jīng)退行變的加重逐步減少，Keratin 5在癌變過(guò)程中變化較小。Keratin 20、Annexin-2的表達(dá)變化與PRXl表達(dá)一致。AChR表達(dá)變化的特征是隨癌變的演進(jìn)開始由

10、胞膜、胞漿隨即逐步減少，而后從胞質(zhì)向核內(nèi)集中或轉(zhuǎn)移。ChAT在癌變及其惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中變化與減少較晚，非典型增生階段呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。 3．2 ACh與NE對(duì)人食管癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖、分化的影響。 3．3 ACh和NE對(duì)阻斷ERK1/2食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞增殖和分化的影響。 4 結(jié)論 4．1食管壁間神經(jīng)纖維在癌變演進(jìn)過(guò)程中逐漸減少或喪失，AChR、ChAT、Annexin-2、PRX1、K20隨癌變的表

11、達(dá)逐步減少。結(jié)果提示，食管壁間神經(jīng)減少或功能喪失可能是食管癌變的神經(jīng)因素。AChR隨癌變始動(dòng)與演進(jìn)的特征性變化是其在胞膜、胞漿的含量減少最早，并從胞質(zhì)向核內(nèi)集中或轉(zhuǎn)移，這可能是引起食管黏膜上皮細(xì)胞對(duì)神經(jīng)性ACh敏感度下降，進(jìn)而導(dǎo)致癌變啟動(dòng)較早的受體事件。PRX1表達(dá)增多可能是受傷害刺激的細(xì)胞維持Annexin-2和Keratin20表達(dá)有效分子，其表達(dá)下降可能是導(dǎo)致細(xì)胞自身保護(hù)和穩(wěn)定功能下降，細(xì)胞癌變與癌細(xì)胞惡化的內(nèi)在原因。 4

12、．2 ACh和NE具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞分化的作用，采用阿托品和妥拉唑啉分別阻斷mAChR和α受體，仍具有促進(jìn)EC9706細(xì)胞分化的作用。結(jié)果提示，食管癌細(xì)胞具有經(jīng)誘導(dǎo)分化或增強(qiáng)分化的能力， ACh和NE可促使細(xì)胞體增大，突起長(zhǎng)出，核質(zhì)比下降，功能蛋白表達(dá)增多，其機(jī)制可能是主要通過(guò)nAChR和B受體。 4．3 ACh和NE對(duì)體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞增殖活性具有降低的作用，表現(xiàn)為將癌細(xì)胞由S期

13、向G1和G2期誘導(dǎo)，或使其周期發(fā)生阻滯，影響細(xì)胞的增殖，該作用經(jīng)多受體、多途徑的調(diào)節(jié)。 4．4 ACh和NE對(duì)體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞Annexin-2 mRNA表達(dá)具有促進(jìn)作用。ACh作用最強(qiáng)，可使其表達(dá)量增加20倍，ACh+阿托品使之增加8倍，NE、NE+托拉唑啉、ACh+NE作用較弱，僅能使之表達(dá)增加2～4倍。 4．5 ERK1/2阻滯劑除具有降低細(xì)胞增殖和阻滯細(xì)胞分化的作用。ACh和NE對(duì)阻斷ERK1