MicroRNA-22-Sp1負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：近年來有關(guān)microRNA(miRNA)方面的研究多且涉及的領(lǐng)域廣，其中在腫瘤方面也成為研究的熱點(diǎn)之一。miRNA是一類主要存在于真核生物細(xì)胞中內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約18-24個(gè)核苷酸，主要通過和靶基因3,UTR的配對(duì)來影響靶基因的作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值、分化、凋亡及腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等一系列的重要生物學(xué)過程。我們的前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，miR-22在結(jié)直腸癌腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)miR-22與患者肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且低表

2、達(dá)miR-22患者預(yù)后較差。Sp1是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，在結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。研究表明Sp1在結(jié)直腸癌中表達(dá)異常升高，且異常高表達(dá) Sp1可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。
　　PTEN是人體中重要的抑癌基因，而且我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，PTEN在結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移中起抑制作用。既往研究證實(shí)，PTEN主要是通過阻斷AKT信號(hào)通路從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。另外，大量有關(guān)腫瘤

3、方面的研究表明miR-22與PTEN呈正相關(guān)。鑒于miR-22、Sp1及PTEN均在結(jié)直腸細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要調(diào)控作用，且研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中miR-22/Sp1之間存在負(fù)反饋環(huán)路，因此我們推測(cè)miR-22/Sp1在結(jié)直腸癌中可能存在負(fù)反饋環(huán)路，進(jìn)而通過抑制PTEN促進(jìn)AKT磷酸化，進(jìn)一步影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，但是目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的：檢測(cè)miR-22在結(jié)直腸癌組織、肝轉(zhuǎn)移組織及細(xì)胞中的表達(dá)；研究miR-22對(duì)結(jié)

4、直腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響及miR-22和Sp1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的相互作用；研究miR-22對(duì)信號(hào)通路PTEN/AKT的影響。通過上述研究證實(shí)MicroRNA-22/Sp1負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為miR-22成為治療結(jié)直腸癌新的靶基因提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.檢測(cè)miR-22在結(jié)直腸癌組織、正常組織、肝轉(zhuǎn)移組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)直腸癌患者癌組織、癌旁正常組織和肝轉(zhuǎn)移組織中mi

5、R-22的表達(dá)及結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT-29、LoVo和Caco-2中miR-22的表達(dá)均采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)。
　　2.miR-22對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)和體外生物學(xué)特性的影響
　?。?）利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染,制備過表達(dá)和表達(dá)抑制miR-22的SW620及LoVo細(xì)胞株，同時(shí)制備過表達(dá)和表達(dá)抑制anti-miR-22的SW480及HT-29細(xì)胞株。利用慢病毒轉(zhuǎn)染制備穩(wěn)定過表達(dá)

6、miR-22的SW620細(xì)胞株。
　?。?）miR-22過表達(dá)或表達(dá)抑制后，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)增值能力，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC細(xì)胞的克隆形成能力，Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC細(xì)胞的侵襲及遷移能力。
　　（3）利用慢病毒轉(zhuǎn)染制備穩(wěn)定過表達(dá)miR-22的SW620細(xì)胞株。經(jīng)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)來了解miR-22過表達(dá)對(duì)裸鼠體內(nèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞成瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.miR-2

7、2靶基因Sp1的證實(shí)
　?。?）利用TargetScan、Pictar和MiRanda生物信息學(xué)基因在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-22的靶基因。
　?。?）利用westernblot、qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-22/miR-nc的SW620細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染anti-miR-22/anti-miR-nc的SW480細(xì)胞株Sp1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，明確miR-22對(duì)Sp1的表達(dá)的影響。
　?。?）利用雙熒光素酶報(bào)告載體系

8、統(tǒng)檢測(cè)miR-22與Sp13，UTR的結(jié)合情況，明確Sp1是否為miR-22直接作用的靶基因。
　?。?）回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-22與Sp1之間的相互作用。將SW620和LoVo細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-22/miR-nc/miR-22+Sp1/Sp1，再次利用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-22過表達(dá)、Sp1過表達(dá)及miR-22和Sp1共表達(dá)對(duì)體外結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成及侵襲遷移能力的影響。
　　4.miR-22/Sp1負(fù)反饋機(jī)制

9、的證實(shí)
　　（1）利用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件TRAVSFAC、JASPAR和 PROMO預(yù)測(cè)miR-22啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。
　?。?）將SW480及HT-29細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Sp1、siSp1及其陰性對(duì)照,利用qRT-PCR檢測(cè)miR-22表達(dá)情況，明確Sp1對(duì)miR-22的表達(dá)的影響。
　　（3）利用雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)，在SW480細(xì)胞及HT-29細(xì)胞中檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1是否直接作用于miR-22啟動(dòng)子序列。

10、
　?。?）免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Sp1與miR-22啟動(dòng)子的直接結(jié)合位點(diǎn)。
　?。?）回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-22與Sp1之間的相互作用，將SW480和HT-29細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Sp1/vector/Sp1+miR-22，再次檢測(cè)miR-22和Sp1共表達(dá)及 Sp1過表達(dá)對(duì)體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增值、克隆形成及侵襲遷移能力的影響。
　　5.miR-22通過抑制Sp1的表達(dá)，從而作用于信號(hào)通路PTEN/AKT的證實(shí)
　

11、　（1）利用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件TRAVSFAC、JASPAR和PROMO預(yù)測(cè)PTEN啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。
　?。?）利用westernblot檢測(cè)miR-22過表達(dá)、miR-22表達(dá)抑制及miR-22/Sp1共表達(dá)后SW480及SW620細(xì)胞株中p-AKT、T-AKT及PTEN蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
　　（3）利用雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)明確Sp1是否直接作用于PTEN。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用IBM SPSS1

12、9.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)或者U檢驗(yàn)分析比較定量資料，采用卡方檢驗(yàn)分析比較定性資料。術(shù)后生存率的分析用Kaplan-Meier法，之間的差異采用時(shí)序檢驗(yàn)（log-rank test）。P＜0.05做為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.miR-22在結(jié)直腸癌組織、細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)量與結(jié)直腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)
　?。?）在結(jié)直腸癌組織中miR-22表達(dá)降低：結(jié)直腸

13、癌組織中miR-22的表達(dá)明顯低于正常的腸粘膜組織（P＜0.05）,有76%(118例中有83例)的癌組織樣本 miR-22的表達(dá)比正常腸粘膜組織降低了4倍以上。miR-22的表達(dá)隨腫瘤TNM分期的增加而逐漸降低（P＜0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-22的表達(dá)較不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低（P＜0.05）。
　　（2）肝臟轉(zhuǎn)移組織中 miR-22表達(dá)比原發(fā)結(jié)直腸癌組織中低（P＜0.05）。
　　（3）miR-22在高轉(zhuǎn)移潛能

14、的細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)：在高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株SW620及LoVo中miR-22的表達(dá)較低轉(zhuǎn)移潛能的SW480、HT-29及Caco-2細(xì)胞株中低（P＜0.05）。
　?。?）miR-22表達(dá)低的患者更容易出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移：經(jīng)外科手術(shù)根治性切除的110例I-III期CRC患者隨訪五年，有31例（28.2%）出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。miR-22低表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高（P＜0.05）。用Kaplan-Meier生存分析同樣提示miR-22

15、低表達(dá)患者術(shù)后更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡。
　　2.miR-22抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
　?。?）在體外結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-22可抑制其生長(zhǎng)增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力：SW620和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22/miR-nc，SW480和HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti- miR-22/anti-miR-nc。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)（MTT、平板克隆形成、侵襲和遷移）結(jié)果顯示：miR-22過表達(dá)后細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成、侵襲及遷移

16、能力降低(P＜0.05)，而miR-22表達(dá)抑制后細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成、侵襲及遷移能力升高(P＜0.05)。
　?。?）裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示：SW620/miR-22組皮下瘤體積小于SW620/Control組(P＜0.05)。
　　（3）轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)顯示：SW620/miR-22組中有6/6例出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，SW620/Control組中6/6例出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，但SW620/Control組與SW620/miR-22組比較顯示轉(zhuǎn)移瘤個(gè)

17、數(shù)多且體積大。
　　3.Sp1是miR-22的靶基因
　?。?）利用生物信息學(xué)基因在線預(yù)測(cè)軟件TargetScan、Pictar和MiRanda預(yù)測(cè)顯示Sp1是miR-22的靶基因之一。
　?。?）westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-22/miR-Nc的SW620細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染anti-miR-22/anti-miR-Nc的SW480細(xì)胞株Sp1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22后Sp1表達(dá)水平下調(diào)（

18、P＜0.05），SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-22后Sp1表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），提示miR-22在細(xì)胞中可以抑制Sp1的表達(dá)。
　?。?）成功構(gòu)建WtSp13，UTR和MutSp13，UTR雙熒光素酶報(bào)告載體。將WtSp13，UTR和MutSp13，UTR以及miR-22/anti-miR-22共轉(zhuǎn)染至HEK293TT細(xì)胞中。在miR-22存在的情況下，WtSp13，UTR的熒光素酶活性下降（P＜0.05），在ant

19、i-miR-22存在的情況下，WtSp13，UTR的熒光素酶活性升高（P＜0.05），而在MutSp13，UTR雙熒光素酶活性均無明顯變化，這表明miR-22可以特異的結(jié)合Sp13，UTR。
　?。?）miR-22通過作用于靶基因Sp1抑制CRC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移將SW620和LoVo細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-22/miR-nc/miR-22+Sp1/Sp1,細(xì)胞功能試驗(yàn)顯示：轉(zhuǎn)染miR-22可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成、侵襲及遷移能力，轉(zhuǎn)染

20、Sp1可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成、侵襲及遷移能力?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染miR-22+Sp1后細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成、侵襲及遷移能力介于轉(zhuǎn)染miR-22和Sp1之間。
　　4.Sp1通過抑制miR-22表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
　?。?）利用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件 TRAVSFAC、JASPAR和 PROMO預(yù)測(cè)miR-22啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在Sp1的結(jié)合位點(diǎn)。
　　（2）將SW480及HT-29細(xì)胞株

21、分別轉(zhuǎn)染Sp1/Nc和siSp1/siNc,利用QRT-PCR檢測(cè)miR-22表達(dá)情況顯示：轉(zhuǎn)染Sp1后miR-22表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染siSp1后miR-22表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。
　?。?）在miR-22啟動(dòng)子序列區(qū)發(fā)現(xiàn)三個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，我們將距離近的結(jié)合位點(diǎn)1、2定義為A位點(diǎn)并擴(kuò)增，將結(jié)合位點(diǎn)3定義為B位點(diǎn)并擴(kuò)增,構(gòu)建野生型熒光素酶報(bào)告載體PGL3-Wt-Luc。雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Sp

22、1可以降低PGL3-Wt-Luc的熒光素酶活性（P＜0.05),說明Sp1可以與miR-22啟動(dòng)子序列直接結(jié)合。
　?。?）CHIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Sp1可以直接結(jié)合于miR-22啟動(dòng)子序列的A位點(diǎn)。
　　（5）Sp1通過作用于miR-22促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移：將SW480和HT-29細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Sp1/vector/Sp1+miR-22，行細(xì)胞功能試驗(yàn)顯示：與vector相比，轉(zhuǎn)染Sp1后SW480和HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)、

23、克隆形成、侵襲及遷移能力明顯增強(qiáng)（P值均＜0.01），而轉(zhuǎn)染Sp1+miR-22后SW480和HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成、侵襲及遷移能力強(qiáng)于轉(zhuǎn)染vector組，但比轉(zhuǎn)染Sp1組弱。
　　5.miR-22通過靶向抑制 Sp1的表達(dá)，從而作用于信號(hào)通路PTEN/AKT
　?。?）利用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件 TRAVSFAC、JASPAR和PROMO預(yù)測(cè)PTEN啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在Sp1的結(jié)合位點(diǎn)。
　?。?/p>

24、2）利用westernblot檢測(cè)SW480及SW620細(xì)胞株miR-22過表達(dá)、miR-22表達(dá)抑制及 miR-22/Sp1共表達(dá)后p-AKT、T-AKT及PTEN蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果提示：miR-22過表達(dá)后PTEN表達(dá)升高，p-AKT表達(dá)降低,T-AKT表達(dá)無顯著變化；miR-22表達(dá)抑制后PTEN表達(dá)降低，p-AKT表達(dá)升高,T-AKT表達(dá)無顯著變化；miR-22/Sp1共表達(dá)后PTEN表達(dá)升高（水平介于miR-22過表達(dá)及miR

25、-22表達(dá)抑制之間），p-AKT表達(dá)降低（水平介于miR-22過表達(dá)及miR-22表達(dá)抑制之間）,T-AKT表達(dá)無顯著變化。
　　（3）Sp1通過抑制PTEN的表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移：雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sp1可直接作用于PTEN啟動(dòng)子序列。
　　結(jié)論：
　　1.miR-22在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)；miR-22在肝轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)比在原發(fā)腫瘤中低；miR-22在具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；miR