Peroxiredoxin Ⅱ在腰椎間盤髓核中的表達及在兔腰椎間盤退變過程中的作用.pdf

1、腰椎間盤退變是引起下腰痛的主要因為,被認為是腰椎間盤突出癥等疾病的病理基礎(chǔ)。腰椎間盤作為一個完整的、相對獨立的結(jié)構(gòu)單元,由纖維環(huán)、髓核和軟骨終板三部分組成,由于生理性及病理性因素的影響,腰椎間盤容易發(fā)生退行性變。其中髓核的退變較纖維環(huán)和軟骨終板更明顯,主要表現(xiàn)為水份含量的降低、蛋白多糖含量的下降和膠原成分的改變。髓核內(nèi)蛋白多糖和水分的丟失可直接影響椎間盤的生物功能,其生物力學(xué)特性也隨之發(fā)生改變,從而引起了一系列的臨床癥狀。
　　

2、 國內(nèi)外對于腰椎間盤退行性疾病的生物學(xué)研究取得了一些進展,特別是近年來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起,對腰椎間盤退變的生化及分子機制的研究也日益深入。目前的研究主要集中在基因遺傳學(xué)、生物力學(xué)和分子生物學(xué)等方面,對分子生物學(xué)的研究是其中的熱點。基因遺傳及生物環(huán)境是椎間盤退變病因的主要因素,而在椎間盤退變發(fā)生過程當(dāng)中,分子生物因素的影響更為重要。多種細胞因子、酶類和蛋白質(zhì)均參與椎間盤的退變,他們在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其中包括:基

3、質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。MMPs是一類蛋白水解酶家族,在椎間盤退變中起重要作用的主要有膠原酶(MMP-1)和中性蛋白多糖酶(MMP-3)。金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的能特異性抑制MMPs活性的一組多功能因子家族,研究發(fā)現(xiàn)MMPs與TIMPs的動態(tài)平衡維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性,MMPs與TIM

4、Ps的失衡是導(dǎo)致細胞外基質(zhì)過度降解的重要因為。許多細胞因子能對MMPs和TIMPs的活性及表達進行調(diào)節(jié)。IL-1β和TNF-α可促進金屬基質(zhì)降解酶(MMPs)的產(chǎn)生和分泌,引起軟骨基質(zhì)的降解,并可抑制軟骨細胞合成具有透明軟骨特性的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原,促進生成有纖維母細胞特性的Ⅰ型膠原,從而使軟骨細胞變性、死亡。IL-6可誘導(dǎo)金屬基質(zhì)降解酶抑制劑(TIMP)而不是MMPs本身,通過負反饋作用來抑制酶的破壞。IL-1使椎間盤纖維環(huán)細胞產(chǎn)生的

5、前列腺E2(PGE2)和磷脂酶A2(PLA-2)增加,且分泌呈劑量依賴性。IL-6能引起軟骨基質(zhì)的蛋白多糖丟失,抑制成纖維細胞的膠原合成。Furusawa證明NO能抑制椎間盤的蛋白多糖合成,用NO合成的競爭抑制劑一氧化氮L-NMA(NG-Methyl-1-argine)不但可以劑量依賴性地抑制NO生成,而且可使椎間盤組織中蛋白多糖的合成增加；反之,用NO合成的促進劑,則蛋白多糖合成降低。有研究發(fā)現(xiàn),退變椎間盤組織TGF-β3的表達下降,

6、TGF-β3可以促進退變椎間盤成纖維細胞Ⅱ型膠原的合成,可以抑制退變晚期椎間盤TGF-β1基因的表達。
　　 總體而言,目前對腰椎間盤退變的研究已較深入和廣泛,當(dāng)中涉及到了很多因素及因子,這些因子互相之間形成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),它們通過相互作用和協(xié)調(diào)來調(diào)控椎間盤退變,但這些散在的因子之間具體的關(guān)聯(lián)怎樣以及是否還有新的因素加入其中還不夠清楚。蛋白質(zhì)作為一種參與構(gòu)成組織結(jié)構(gòu)、生物信息傳遞和表達,影響生命活動的大分子物質(zhì),在人體各組織和

7、各種疾病及生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。任何一類生命活動幾乎都離不開蛋白質(zhì)的作用,也就造成了蛋白質(zhì)在不同生命活動狀態(tài)中的表達存在差異。差異蛋白組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要方向之一,人類重大疾病的蛋白質(zhì)組研究通常采用比較蛋白質(zhì)組分析方法。運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),比較病變組織(細胞)與其起源的正常組織(細胞)或疾病發(fā)展不同階段組織中蛋白質(zhì)在表達數(shù)量、表達水平和修飾狀態(tài)上的差異,可以發(fā)現(xiàn)與病變相關(guān)的特異蛋白質(zhì),這些疾病相關(guān)的特異蛋白質(zhì)不僅可為

8、研究疾病發(fā)病機制提供線索,而且可作為疾病診斷的治療的生物標志物。比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤的發(fā)病機制中應(yīng)用尤其廣泛。腫瘤細胞是由正常細胞轉(zhuǎn)變而來,與其起源的正常細胞相比。它不僅含有一些正常細胞所沒有的某些特異蛋白質(zhì)或缺少正常細胞相同的蛋白質(zhì),而且也有許多與正常細胞相同的蛋白質(zhì),只不過這些蛋白質(zhì)可能在表達水平或翻譯后的修飾加工上與正常細胞存在差別。因此,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)比較患同一腫瘤的不同個體的腫瘤組織(細胞)之間或同一個體腫瘤細胞與

9、正常起源細胞之間蛋白質(zhì)在表達數(shù)量、表達位置和修飾狀態(tài)上的差異,可以發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的特異性蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)既可作為腫瘤診斷的分子標記,又可作為治療和藥物開發(fā)的靶點。而國內(nèi)外文獻還鮮有對腰椎間盤退變總體蛋白差異的研究報道,我們前期通過雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析,對正常和退變腰椎間盤髓核進行差異蛋白研究,發(fā)現(xiàn)在正常及退變的椎間盤髓核中存在多種差異蛋白,Peroxiredoxin Ⅱ(PrxⅡ)為其中的一種。通過對國內(nèi)外文獻檢索,我們發(fā)現(xiàn)Prx Ⅱ

10、蛋白是過氧化物酶家族中的一員,廣泛的存在于人體的組織器官內(nèi),并對生物體內(nèi)的氧自由基清除、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖及凋亡等方面有著明確的影響,而氧自由基的清除、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細胞的增殖和凋亡與腰椎間盤退變的關(guān)系密切,由此我們推測Prx Ⅱ可能通過其相關(guān)作用機制在影響著椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展,但目前國內(nèi)外文獻尚無對Prx Ⅱ在椎間盤退變中的表達及對腰椎間盤退變作用的相關(guān)報道,因此,我們擬對Prx Ⅱ在腰椎間盤退變中的相關(guān)作用進行初步研究,使用

11、蛋白免疫印跡(Western blot)進一步明確Prx Ⅱ在椎間盤髓核組織中的表達情況,并通過動物模型實驗探尋Prx Ⅱ在腰椎間盤退變過程中的可能作用,為深入研究Prx Ⅱ蛋白在腰椎間盤退變過程中作用機制及更好的明確腰椎間盤退變的復(fù)雜機理提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一章 Prx Ⅱ在腰椎間盤髓核組織中的表達
　　 目的:
　　 采用Western blot方法明確Prx Ⅱ在正常及退變椎間盤髓核中的差異表達,為進一

12、步研究Prx Ⅱ蛋白在腰椎間盤退變中的作用提供基礎(chǔ)。
　　 材料及方法:
　　 (一)、收集2008年3月-2009年4月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院骨科中心突出及脫出腰椎間盤髓核組織手術(shù)標本42例,年齡28～65歲,男22例,女20例；其中突出組織26例,脫出組織16例；取材范圍L3～L5。所有腰椎間盤退變患者臨床表現(xiàn)均有出現(xiàn)1年以上明顯的腰腿痛癥狀,并由MRI證實為腰椎間盤突出或腰椎間盤脫出,術(shù)后病理切片證實椎間盤髓核退變；

13、收集正常及新鮮骨折腰椎間盤髓核標本10例,其中男6例,女4例,年齡21-45歲,平均年齡32歲,取材范圍L3-L5。
　　 (二)、通過Western blot檢測所有標本中 Prx Ⅱ的表達,數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,Western blot結(jié)果所得結(jié)果用(x)±s表示,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett's T3檢驗進行分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過Western blot對

14、正常、突出及脫出髓核組織標本的Prx Ⅱ蛋白進行檢測發(fā)現(xiàn):在22KD附近有明顯蛋白表達的條帶,Prx Ⅱ蛋白表達在突出及脫出髓核組織高于正常髓核組織,以β-actin內(nèi)參對照,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)正常髓核與突出髓核及正常髓核與突出髓核間兩兩比較差異顯著(P<0.001),有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.而Prx Ⅱ的表達在突出髓核組織低于脫出髓核組織,但差異無顯著性(P=0.243),無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 我

15、們通過Western blot檢測Prx Ⅱ在腰椎間盤髓核組織的表達,發(fā)現(xiàn)Prx Ⅱ在正常髓核組織的表達低于突出及脫出髓核組織,而突出和脫出髓核組織中表達差異不明顯。
　　 第二章 Prx Ⅱ在兔腰椎間盤退變過程中的作用
　　 目的:
　　 構(gòu)建兔腰椎間盤退變模型,通過Prx Ⅱ?qū)ν俗兡Ｐ瓦M行干預(yù),探尋Prx Ⅱ在兔腰椎間盤退變過程中的作用。
　　 方法:
　　 將24只新西蘭大白兔隨機分成高濃度

16、組(n=8)、低濃度組(n=8)和對照組(n=8)。用纖維環(huán)穿刺法制作兔腰椎間盤退變模型(L3/4-5/6)。造模成功后,用微量注射器將濃度為1mg/ml、10 μg/ml的Prx Ⅱ分別注入高濃度組和低濃度組L3/4-L5/6椎間盤髓核中,將1％PBS注入對照組椎間盤髓核中,三組注入量均為25 μ1,在Prx Ⅱ注射后2、4、12、16周每組各隨機選取2只兔,分別采用?方法行蛋白多糖及膠原測定,并行MRI檢查了解髓核組織的退變程度。數(shù)

17、據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)結(jié)果計量資料用(x)±s表示,采用析因設(shè)計的方差分析及單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗及Dunnett's T3檢驗:MRI結(jié)果資料采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis H檢驗,組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。
　　 結(jié)論:
　　 損傷后椎間盤退變是一個逐步加重的過程表現(xiàn)為MRI T2信號減低,髓核面積減小,蛋白多糖及膠原蛋白含