生長因子progranulin在骨修復(fù),皮膚炎癥以及椎間盤退變過程中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、第一部分生長因子Progranulin在骨修復(fù)過程中的作用和機(jī)制研究
　　 研究背景:
　　 大面積骨缺損的治療一直是一個(gè)困擾臨床醫(yī)生的技術(shù)難題。除骨移植外，生長因子，生物材料及相關(guān)干細(xì)胞研究的組織工程學(xué)為治療大面積骨缺損提供了新的治療思路。生長因子progranulin(PGRN)是一種多功能蛋白，已經(jīng)有研究證明PGRN在發(fā)育過程中可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化及軟骨內(nèi)成骨。我們知道在骨修復(fù)過程中軟骨形成軟骨痂后成骨，對修復(fù)缺損

2、起到非常關(guān)鍵的作用。且近期發(fā)現(xiàn)，PGRN通過與腫瘤壞死因子TNF-α的受體TNFR1/2相結(jié)合，保護(hù)了免疫性關(guān)節(jié)炎中骨組織不受侵蝕。生長因子PGRN促軟骨細(xì)胞分化，抑破骨的作用引起我們濃厚興趣，是否可將PGRN引入治療大面積骨缺損呢？直至目前，PGRN在骨修復(fù)過程中所起作用及其可能涉及的相關(guān)機(jī)制尚無報(bào)道。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用多種轉(zhuǎn)基因小鼠，包括野生型小鼠，PGRN基因缺失小鼠，TNFR1基因缺失

3、小鼠，TNFR2基因缺失小鼠，TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠并應(yīng)用多種手術(shù)誘導(dǎo)模型包括橈骨節(jié)段性骨缺損模型，股骨鉆孔骨缺損模型，肌肉內(nèi)異位骨生成模型和股骨節(jié)段性骨缺損模型研究PGRN在骨修復(fù)過程中的作用和相關(guān)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)誘導(dǎo)的骨缺損模型中，PGRN基因缺失型小鼠出現(xiàn)骨修復(fù)過程遲緩，主要表現(xiàn)為節(jié)段性骨缺損模型建立后，在各個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)的骨斷端間距較野生型對照組明顯增大，提示新骨形成緩慢，而局

4、部使用PGRN重組蛋白可加速野生型小鼠節(jié)段性骨缺損的骨修復(fù)過程。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)PGRN在BMP-2（骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2）誘導(dǎo)的骨生成過程中起到不可或缺的作用，因?yàn)镻GRN基因缺失型小鼠中BMP-2誘導(dǎo)的異位骨生成較野生型小鼠顯著減少，且軟骨內(nèi)成骨過程明顯減緩，而在PGRN基因缺失型小鼠中使用PGRN重組蛋白治療后可以改善基因缺失導(dǎo)致的BMP-2異位成骨誘導(dǎo)不良現(xiàn)象。另外，我們發(fā)現(xiàn)PGRN介導(dǎo)的促骨修復(fù)作用與TNFR2密切相關(guān)。CT等

5、影像學(xué)結(jié)果顯示，在TNFR2基因缺失型小鼠中，上述PGRN促骨修復(fù)作用幾乎完全消失。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，BMP-2介導(dǎo)的異位骨形成在TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中被明顯抑制。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中，新生骨的邊緣部分破骨細(xì)胞異?；钴S，提示TNF-α的過量表達(dá)導(dǎo)致了新生骨侵蝕加劇，最終使新生骨量減少。我們將PGRN重組蛋白與BMP-2同時(shí)作用于TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種成骨減少現(xiàn)象明顯改善，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PGRN的治療使TNF-α

6、轉(zhuǎn)基因小鼠中破骨細(xì)胞活性降低，這提示了PGRN在骨修復(fù)過程中也可能是通過抑制炎性反應(yīng)及過度活躍的破骨細(xì)胞活性起作用的。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過使用多種轉(zhuǎn)基因小鼠及數(shù)種手術(shù)誘導(dǎo)模型，驗(yàn)證了PGRN在骨修復(fù)過程中起到促軟骨細(xì)胞分化，抑破骨的作用。機(jī)制方面的研究顯示，這種作用是通過與BMP-2及TNF-α/TNFR通路相互作用來實(shí)現(xiàn)的，這也提示我們PGRN有可能成為治療骨缺損的新分子，尤其在患者處于炎性狀態(tài)時(shí)發(fā)揮其獨(dú)特

7、作用。
　　 第二部分生長因子progranulin及其衍生工程蛋白Atsttrin在皮膚炎癥中的保護(hù)功能及機(jī)制研究
　　 研究背景:
　　 皮膚炎性疾病，包括銀屑病等，屬于免疫炎性疾病的一類，困擾著大量患者。但到目前為止，其發(fā)病機(jī)制及治療措施仍然有待進(jìn)一步研究。在多種皮膚炎癥的發(fā)病過程中，最重要的細(xì)胞因子之一是腫瘤壞死因子(TNF-α)，起到非常關(guān)鍵的作用。TNF-α可以通過激活相關(guān)炎性通路如NF-κB信號通路

8、從而促進(jìn)下游因子表達(dá)，繼而導(dǎo)致炎癥發(fā)生。因此，對TNF-α的拮抗就成為非常有前景的治療方法之一。到目前為止，已經(jīng)有數(shù)種針對TNF-α的藥物應(yīng)用于臨床，并在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，銀屑病以及潰瘍性結(jié)腸病等疾病中發(fā)揮治療作用。然而，目前所開發(fā)的抗TNF-α藥物應(yīng)用于自身免疫性疾病患者后，仍有約半數(shù)患者對這些治療藥物反應(yīng)不敏感或無效。因此，進(jìn)一步開發(fā)新的TNF-α相關(guān)抑制劑對于治療這些患者來說是十分必要的。Progranulin（PGRN）是一種多功能

9、蛋白，在諸多生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。PGRN以及其衍生工程蛋白Atsttrin已被報(bào)道可以通過與TNF-α的細(xì)胞表面受體TNFR1/2相互結(jié)合拮抗TNF-α所導(dǎo)致的NF-κB信號通路激活和炎性作用，并在小鼠模型中對抗免疫性關(guān)節(jié)炎(Tang，W.，等，Science，2011)。PGRN及Atsttrin的拮抗機(jī)制與前期藥品不同，因?yàn)榍捌趹?yīng)用于臨床的TNF-α抑制劑主要包括TNF-α的抗體或TNF-α受體類似物，通過捕獲TNF-α，

10、封閉其結(jié)合位點(diǎn)，從而防止其與細(xì)胞表面受體TNFR1/2相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對TNF-α功能的抑制，而PGRN及Atsttrin則通過與TNF-α受體競爭性結(jié)合起到抗炎作用。直至目前，PGRN在皮膚炎癥中的作用尚無人報(bào)道。因此，在本課題中，我們使用相關(guān)實(shí)驗(yàn)，研究PGRN及Atsttrin在皮膚炎癥中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.PGRN在人和小鼠正常皮膚組織中的表達(dá)由免疫組化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western蛋

11、白印跡實(shí)驗(yàn)檢測。
　　 2.在野生型小鼠和PGRN基因缺失型小鼠中誘導(dǎo)oxazolone皮膚炎癥模型，通過組織學(xué)，qPCR，WB以及流式細(xì)胞技術(shù)等方法，對比野生型小鼠和PGRN基因缺失型小鼠中皮膚炎癥的發(fā)生發(fā)展情況及使用Atsttrin治療后皮膚炎癥的差別。
　　 3.在各個(gè)實(shí)驗(yàn)小組中對NF-κB信號通路的指標(biāo)進(jìn)行檢測。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.免疫組化示，PGRN在人和小鼠皮膚中均有表達(dá)。qPCR及

12、WB發(fā)現(xiàn)PGRN在皮膚炎性疾病中表達(dá)上升。
　　 2.Oxazolone誘導(dǎo)的皮炎模型中，較之野生型小鼠，PGRN基因缺失小鼠的皮炎程度加重，表現(xiàn)在誘導(dǎo)后鼠耳外觀腫脹，厚度增加，同時(shí)qPCR示炎性反應(yīng)的相關(guān)標(biāo)志性分子包括包括白細(xì)胞介素1(IL-1β)，白細(xì)胞介素6(IL-6)，環(huán)氧化酶2(COX-2)以及誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá)增多。另外，流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果示在PGRN基因缺失小鼠頸部引流淋巴結(jié)中，其調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比

13、例較野生型明顯降低。使用PGRN衍生的工程蛋白Atsttrin治療后，在野生型小鼠中，Oxazolone誘導(dǎo)的皮炎得以明顯控制，包括誘導(dǎo)后耳厚度增加程度，即耳腫脹程度得以控制;組織學(xué)發(fā)現(xiàn)表皮組織因皮炎所致的增生程度降低，而炎性相關(guān)的標(biāo)志性分子如白細(xì)胞介素1(IL-1β)，白細(xì)胞介素6(IL-6)，環(huán)氧化酶2(COX-2)以及誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)水平也相較于PBS對照治療組顯著性下降。
　　 3.我們發(fā)現(xiàn)PGRN及At

14、sttrin在皮膚炎癥中的保護(hù)性作用可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的活性來實(shí)現(xiàn)的。在Oxazolone誘導(dǎo)的皮炎模型中，PGRN基因缺失小鼠局部皮膚中NF-κB信號通路組成部分NF-κB2的表達(dá)上升，而NF-κB通路抑制分子IκB的磷酸化加強(qiáng)，反映NF-κB通路活性增強(qiáng)。同時(shí)，在野生型皮炎模型中使用Atsttrin治療后，皮炎中增強(qiáng)的NF-κB信號通路活性得以有效控制。
　　 結(jié)論:
　　 我們研究發(fā)現(xiàn)皮膚炎癥中PGRN

15、表達(dá)上調(diào)。構(gòu)建動(dòng)物模型證明PGRN缺失致使皮炎程度加劇，Atsttrin治療后可減輕皮炎程度。并進(jìn)一步探究了參與此過程的NF-κB信號通路的活性變化。這一研究不但首次觀察了內(nèi)源性PGRN在皮膚炎癥中的作用，也提示其衍生工程蛋白Atsttrin可能作為一種治療炎性皮膚疾病的新型藥物，應(yīng)用于未來臨床之中。
　　 第三部分生長因子progranulin在椎間盤退變中的保護(hù)性作用研究
　　 研究背景:
　　 椎間盤退行性

16、變是發(fā)病率最高的退行性疾病之一，由多種因素引起。其特征為椎間盤在形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)方面發(fā)生顯著性變化，體現(xiàn)在新骨形成，軟骨破壞和破骨活躍，并最終導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)紊亂，活動(dòng)受限，且可出現(xiàn)下腰痛癥狀。在這一退變過程中所涉及的相關(guān)分子機(jī)制尚不明確，目前尚無有效控制或逆轉(zhuǎn)的治療措施。Progranulin(PGRN)作為一種多功能生長因子，與神經(jīng)及關(guān)節(jié)軟骨退變性疾病有密切關(guān)系。近期，有研究發(fā)現(xiàn)PGRN可以競爭性結(jié)合腫瘤壞死因子TNF-α的受體TNF

17、R1/2，抑制免疫性關(guān)節(jié)炎模型中NF-κB信號通路的激活，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨不受破壞。另有報(bào)道稱在神經(jīng)系統(tǒng)中，PGRN的缺失可導(dǎo)致wnt/β-catenin信號通路激活。而NF-κB和wnt/β-catenin通路與椎間盤退變關(guān)系密切。然而，PGRN在椎間盤退變過程中的作用尚無相關(guān)報(bào)道;是否通過上述兩條通路發(fā)揮作用有待進(jìn)一步求證。此實(shí)驗(yàn)主要研究正常以及退變狀態(tài)下PGRN在椎間盤組織的表達(dá)情況，探索PGRN在椎間盤老化退變過程中的作用，并闡

18、述相關(guān)分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化(IHC)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)以及Western免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)技術(shù)(WB)檢測人與小鼠椎間盤中PGRN的表達(dá)情況。
　　 2.對4月齡，6月齡及9月齡的野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎間盤進(jìn)行HE染色分析一般形態(tài)學(xué)變化;Safranin O染色分析軟骨成分變化;IHC檢測椎間盤基質(zhì)aggrecan的降解產(chǎn)物;破骨細(xì)胞活性由TRAP染色檢

19、測。另外進(jìn)行影像學(xué)CT檢測。qPCR檢測椎間盤退變標(biāo)志性基因的mRNA水平，包括堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(osteocalcin)，金屬蛋白酶13(MMP13)，10型膠原，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及織蛋白酶K(Cathepsin K)。
　　 3.野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎間盤組織中NF-(k)B和wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)與活性也通過qPCR, WB及免疫組化實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測。
　　 實(shí)

20、驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PGRN在人和小鼠的椎間盤中均有表達(dá)，qPCR以及WB結(jié)果證實(shí)PGRN水平隨老化過程而升高。
　　 2.通過比較不同年齡組野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎間盤自發(fā)性退變過程，發(fā)現(xiàn)PGRN基因缺失型小鼠椎間盤組織終板出現(xiàn)骨贅形成，而相鄰椎體內(nèi)松質(zhì)骨出現(xiàn)骨質(zhì)疏松情況。Safranin O染色及aggrecan降解產(chǎn)物的免疫組化結(jié)果顯示，PGRN基因缺失時(shí)椎間盤組織中軟骨結(jié)構(gòu)破壞明顯加重

21、，退變臨床評分明顯高于野生型對照組。另外，與同年齡野生型小鼠相比，qPCR示PGRN基因缺失型小鼠椎間盤組織中的軟骨退變相關(guān)指標(biāo)水平顯著性上升。
　　 3.在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PGRN基因缺失導(dǎo)致椎間盤組織中NF-KB和wnt/β-catenin信號通路相關(guān)組分表達(dá)升高，活性增強(qiáng)，分析退變加速可能是由過度激活此二種信號通路所致。
　　 結(jié)論:
　　 PGRN在維持椎間盤組織穩(wěn)態(tài)中起到非常重要的作用，PGRN基因缺失導(dǎo)致椎