力生長因子E肽在臨界骨缺損修復(fù)中的作用及機制.pdf

1、腫瘤、創(chuàng)傷、感染等因素所造成的大面積骨缺損修復(fù)一直是困擾骨科醫(yī)生的難題。目前，骨缺損的治療主要還是依賴傳統(tǒng)的骨移植術(shù)，但傳統(tǒng)方式一般會經(jīng)歷多次手術(shù)、存在諸多副作用及因手術(shù)失敗引起的截肢或喪失骨負(fù)重等可能性，因此迫切需要新的替代方法以滿足臨床治療需求。生長因子的應(yīng)用為骨缺損治療提供了一種可供選擇的治療方式。目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)的用于臨床骨修復(fù)的生長因子主要是BMPs家族蛋白，其中rhBMP-2的活性最強，但在臨床運用中rhBMP-2卻存在治療

2、費用較高，有效劑量難以控制易導(dǎo)致異位成骨、過量成骨、新生骨快速吸收等成骨異?，F(xiàn)象出現(xiàn)。本文針對rhBMP-2在臨床運用中出現(xiàn)的問題，試圖尋找到一種替代因子或與rhBMP-2聯(lián)用能解決其成骨異常問題的因子。力生長因子E肽(C-terminal24-amino acid peptide of mechano growth factor，MGF24E)是近年來引起廣泛關(guān)注的一個功能活性多肽，是受損組織表達(dá)的一種IGF-Ⅰ選擇性剪接變體，實驗已

3、證明它能保護(hù)受損組織及細(xì)胞，促進(jìn)損傷修復(fù)?；诒菊n題組對MGF24E的前期研究成果，本研究從影像學(xué)、組織學(xué)以及生物力學(xué)等多方面證實了力生長因子E肽(MGF24E)以及MGF24E+rhBMP-2聯(lián)合用藥在臨界骨缺損修復(fù)中的積極作用，同時在細(xì)胞學(xué)水平、基因水平以及蛋白質(zhì)水平探討了損傷修復(fù)機制。研究的主要內(nèi)容和所取得的結(jié)果如下：
　　 1.在制備了1mm左右間隙的SD大鼠橈骨開放性骨折模型的基礎(chǔ)上，利用前期制備的MGF/MGF24E

4、兔抗人多抗，采用Western blot技術(shù)檢測和分析大鼠骨折修復(fù)組織中MGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示截骨損傷組織中MGF蛋白表達(dá)在術(shù)后1天即上升到較高值，術(shù)后第3天達(dá)到最高值，隨后表達(dá)量雖有下降但仍維持較高表達(dá)。
　　 2.從影像學(xué)和組織學(xué)的觀察及分析角度，綜合評價外源MGF24E注射修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨折的效果。
　　 ①高劑量MGF24E修復(fù)兔橈骨5mm節(jié)段性骨折的臨床愈合時間，較MGF24E低劑量組和陰性對照組提早

5、2周；MGF24E高劑量組重建骨組織為髓腔貫通的管狀骨，其修復(fù)情況明顯好于MGF24E低劑量組和陰性對照組；
　　 ②高劑量MGF24E能顯著促進(jìn)骨折重建組織的血管新生，組織學(xué)評分結(jié)果顯示高劑量組樣本新生血管數(shù)為陰性對照組的2倍以上。
　　 3.采用2％FBS血清饑餓細(xì)胞模型，以PBS為陰性對照、100 ng/mL VEGF165為陽性對照，考察MGF24E對人靜脈內(nèi)皮：EA.hy926細(xì)胞增殖、遷移和體外管腔形成的影響

6、；以PBS為陰性對照，10％FBS正常培養(yǎng)條件為陽性對照，考察10 ng/mLMGF24E對人靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞VEGF和Ang-Ⅰ的mRNA及蛋白表達(dá)的影響；同時還研究了MAPK/ERK通路在MGF24E影響血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管化細(xì)胞行為及其分子機制中的作用。
　　 ①10 ng/mL MGF24E促細(xì)胞增殖能力等效于100 ng/mL VEGF165，MGF24E促細(xì)胞增殖是通過增加S期細(xì)胞數(shù)目和促進(jìn)細(xì)胞DNA合成

7、的方式完成，并完全依賴MAPK/ERK信號通路；
　　 ②MGF24E促細(xì)胞遷移、管腔形成的能力明顯強于PBS陰性對照，但弱于VEGF165，并發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK通路部分參與了MGF24E促細(xì)胞遷移、管腔形成等事件；
　　 ③MGF24E能逆轉(zhuǎn)血清饑餓引起的正常生長細(xì)胞VEGF和Ang-Ⅰ表達(dá)下調(diào)的趨勢，其上調(diào)量高于正常培養(yǎng)組的表達(dá)量，并發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK通路部分參與了MGF24E上調(diào)VEGF和Ang-Ⅰ表達(dá)的整個過

8、程。
　　 4.采用7％FBS血清饑餓細(xì)胞模型，以PBS為陰性對照、100ng/mLVEGF165+50ng/mL rhBMP-2的聯(lián)合用藥為陽性對照，25 ng/mL MGF24E、50ng/mLrhBMP-2單給藥為聯(lián)合用藥組的增效參照，考察25 ng/mL MGF24E+50ng/mLrhBMP-2聯(lián)合用藥對原代成骨細(xì)胞增殖、遷移、分化早期指標(biāo)ALP活性以及礦化鈣分泌量表達(dá)的影響，并研究其分子機制。
　　 ①MGF

9、24E促細(xì)胞增殖能力強于rhBMP-2和PBS，相對于MGF24E或rhBMP-2單獨給藥，MGF24E+rhBMP-2聯(lián)合用藥對促進(jìn)細(xì)胞DNA合成、遷移和分化礦化有協(xié)同增效作用；陽性對照除對促進(jìn)細(xì)胞遷移有協(xié)同增效作用外，在其他成骨相關(guān)細(xì)胞生理行為上均表現(xiàn)為拮抗抑制作用：
　　 ②MGF24E+rhBMP-2聯(lián)合用藥在細(xì)胞分化礦化事件上的協(xié)同增效作用主要涉及調(diào)控成骨信號通路的轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因和骨基質(zhì)形成的OPN基因表達(dá)上調(diào)

10、。
　　 5.以可吸收明膠海綿(Absorbable Gelatin Sponge，AGS)作為載體，采用低溫負(fù)壓物理吸附法制備4種不同給藥方案的復(fù)合生長因子支架，并對復(fù)合支架的形貌結(jié)構(gòu)、孔隙率、生長因子的體外釋放以及支架細(xì)胞相容性等性能進(jìn)行評價。
　　 ①掃描電鏡結(jié)果顯示，生長因子成球狀分布于復(fù)合AGS支架內(nèi)部，支架孔徑和孔隙率能滿足成骨細(xì)胞長入；
　　 ②體外釋放結(jié)果顯示，不同復(fù)合支架中生長因子的體外釋放均發(fā)

11、生突釋現(xiàn)象，其中MGF24E釋放最快，rhBMP-2釋放最慢，生長因子的釋放規(guī)律可滿足機體對MGF24E需求以及臨床上rhBMP-2的一次性高濃度給藥方式；
　　 ③復(fù)合支架中成骨細(xì)胞活性實驗結(jié)果顯示，各組復(fù)合支架表現(xiàn)出細(xì)胞相容性差異，聯(lián)合用藥組和MGF24E組支架的細(xì)胞相容性優(yōu)于rhBMP-2組和陰性對照支架。
　　 6.建立了兔橈骨15mm節(jié)段性臨界骨缺損模型，以PBS為陰性對照、80ggrhBMP-2為陽性對照，從

12、影像學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)三方面考察200gg MGF24E和200gg MGF24E+80μg rhBMP-2聯(lián)合用藥對臨界骨缺損修復(fù)的作用；依據(jù)成骨相關(guān)蛋白OPN和新生血管標(biāo)記蛋白CD31的表達(dá)規(guī)律分析MGF24E和MGF24E+rhBMP-2聯(lián)合用藥的臨界骨缺損修復(fù)機制。
　　 ①影像學(xué)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥修復(fù)臨界骨缺損的骨皮質(zhì)橋接愈合時間為12周，骨痂橋接的臨床愈合時間為4周，早于rhBMP-2組；rhBMP-2組樣本愈合經(jīng)

13、歷了過度成骨，新生骨快速吸收(尺橈骨融合現(xiàn)象)的過程，聯(lián)合用藥完全逆轉(zhuǎn)了rhBMP-2骨修復(fù)異常的趨勢；術(shù)后12周MGF24E組雖只有50％樣本達(dá)到骨皮質(zhì)愈合標(biāo)準(zhǔn)，但遠(yuǎn)多于陰性對照組；各組4-12周骨改建時期影像學(xué)修復(fù)情況符合時間的線性函數(shù)關(guān)系；
　　 ②組織學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后初期聯(lián)合用藥組和MGF24E組支架的組織相容性優(yōu)于rhBMP-2組和陰性對照支架；組織學(xué)分析顯示聯(lián)合用藥組愈合情況最好，優(yōu)于rhBMP-2組和MGF24E組

14、，表現(xiàn)出聯(lián)合用藥的協(xié)同增效作用；各組組織學(xué)愈合情況滿足時間的對數(shù)函數(shù)關(guān)系；
　　 ③生物力學(xué)試驗結(jié)果顯示，雖然各用藥組缺損區(qū)重建組織骨質(zhì)連續(xù)，但其力學(xué)性能仍低于正常橈骨組織；各用藥組樣本剛度依次為：聯(lián)合用藥組>rhBMP-2組>MGF24E組，樣本彎曲強度剛度依次為：聯(lián)合用藥組>MGF24E組>rhBMP-2，組聯(lián)合用藥組在力學(xué)性能上表現(xiàn)出協(xié)同增效作用；
　　 ④修復(fù)機制研究結(jié)果顯示，用藥組骨缺損愈合方式為軟骨內(nèi)成骨；M

15、GF24E組能提早啟動骨基質(zhì)合成和血運恢復(fù)，因此含有MGF24E的聯(lián)合用藥組樣本新骨形成量多于rhBMP-2組，但MGF24E的這種促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在術(shù)后初期，隨著rhBMP-2組樣本血運的逐漸恢復(fù)，聯(lián)合用藥組和rhBMP-2組間新骨形成差異逐漸減小。
　　 綜上所述，MGF24E既能顯著地促血管新生，又能在一定程度上促進(jìn)體內(nèi)成骨，因此MGF24E+rhBMP-2聯(lián)合用藥能使臨界骨缺損提早愈合，其修復(fù)質(zhì)量也優(yōu)于rhBMP-2或M