淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)的分子機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　本研究通過建立兔顱骨缺損模型，分別通過淫羊藿苷灌胃全身用藥、CGF纖維蛋白凝膠膜覆蓋顱骨缺損面，在不同時(shí)間點(diǎn)采用大體觀察、X線觀察、組織學(xué)觀察、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)研究，探討淫羊藿苷、CGF促進(jìn)骨缺損的誘導(dǎo)作用，采用兔全基因組芯片分析淫羊藿苷、CGF對(duì)促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)過程中基因表達(dá)譜差異。采用Real-TimePCR和Western blot分析的方法探討淫羊藿苷、CGF促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)主要信號(hào)誘導(dǎo)通路。
　　方

2、法:
　　第一部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)形態(tài)學(xué)觀察
　　1.動(dòng)物及分組:72只新西蘭大白兔隨機(jī)分為對(duì)照組、淫羊藿苷組和CGF組。
　　對(duì)照組:造兔顱骨缺損后，緊密縫合骨膜及皮膚，不做任何干預(yù)措施，待其骨缺損自然愈合。術(shù)后第一天開始，每天一次在進(jìn)食前按1ml/kg定量生理鹽水灌胃;
　　淫羊藿苷組:造兔顱骨缺損后，緊密縫合骨膜及皮膚，淫羊藿苷中藥全身用藥。術(shù)后第一天開始，每天按等劑量淫羊藿

3、苷中藥灌胃;
　　CGF組:造兔顱骨缺損后，制取CGF纖維蛋白凝膠膜覆蓋充填在局部骨缺損處，分層緊密縫合骨膜及皮膚，關(guān)閉創(chuàng)面。
　　2.手術(shù)實(shí)驗(yàn)過程:按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，10％水合氯醛全麻下手術(shù)造直徑15mm兔顱骨缺損。對(duì)照組術(shù)后第一天開始每日按照1ml/kg給予定量生理鹽水灌胃，淫羊藿苷組術(shù)后第一天開始每日給予等劑量淫羊藿苷灌胃，CGF組術(shù)中給予CGF纖維蛋白凝膠膜覆蓋顱骨缺損區(qū)，術(shù)后自由取食水。分別于術(shù)后2周、4周、8周、

4、12周處死動(dòng)物，無菌條件下切取缺損區(qū)新生組織標(biāo)本，進(jìn)行大體觀察并拍攝X線片以觀察顱骨缺損區(qū)愈合情況。
　　3.組織學(xué)觀察:骨組織脫礦制作組織切片，進(jìn)行HE染色、免疫組化，觀察兔顱骨缺損區(qū)骨修復(fù)愈合情況。
　　4.骨計(jì)量學(xué)觀察:鏡下觀察三種方法對(duì)缺損新生組織區(qū)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的數(shù)量和特點(diǎn)的影響，骨小梁平均寬度和面積，以及在不同愈合階段對(duì)成骨速度和新生骨質(zhì)量的影響。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析:采用方差分析各組間骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)之間差

5、異。P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)的基因表達(dá)譜差異分析
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物給藥同第一部分。
　　2.總RNA提取及純化:三組動(dòng)物分別于術(shù)后2、4周處死，無菌條件下截取缺損區(qū)新生組織，液氮環(huán)境中研磨，提取并純化總RNA。并測定總RNA濃度、純度及完整性。
　　3.Affymetrix全基因組mRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)。
　　4.生

6、物信息軟件分析:采用Robust Multichip Analysis（RMA）歸一化方法處理分析，三組間兩兩對(duì)比篩選差異基因，選擇上調(diào)大于2倍的基因和下調(diào)大于2倍的基因，并進(jìn)行代謝途徑pathway分析。
　　第三部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路的探討
　　1.動(dòng)物分組，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同第一部分
　　2.顱骨缺損區(qū)新生組織mRNA提取、純化同第二部分
　　3.將第二部分實(shí)驗(yàn)篩選出

7、的淫羊藿苷組與對(duì)照組對(duì)比差異基因HGF和CGF組與對(duì)照組對(duì)比差異基因Runx2上下游引物由上海生工分別合成。
　　4.利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶變性RNA和引物，并加入反應(yīng)液，合成cDNA第一鏈。
　　5.Real-Time PCR，以上述合成cDNA第一鏈為模板，通過Real-Time PCR擴(kuò)增，以2-(△Ctsample-△Ctcontrol)法進(jìn)行計(jì)算，去檢測淫羊藿苷組與對(duì)照組HGF mRNA表達(dá)情況、檢測CGF組與對(duì)照

8、組Runx2mRNA表達(dá)情況。
　　6.提取顱骨缺損區(qū)新生組織蛋白，通過Western blot分析檢測淫羊藿苷組與對(duì)照組HGF蛋白表達(dá)情況、CGF組與對(duì)照組Runx2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)形態(tài)學(xué)觀察
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體觀察。
　　2.X線觀察。
　　3.HE染色觀察。
　　4.骨計(jì)量學(xué)觀察。
　　5.免疫組織化學(xué)檢測BM

9、P-2和TGFβ1蛋白表達(dá)結(jié)果。
　　第二部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)的基因表達(dá)譜差異分析
　　1.mRNA純度及完整性鑒定
　　對(duì)照組，淫羊藿苷組和CGF組RNA的OD260/OD280比值均位于1.9～2.0之間，純度及濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。凝膠電泳結(jié)果顯示，對(duì)照組，淫羊藿苷組和CGF組RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見三個(gè)條帶出現(xiàn)，且第一條帶(28S)亮度約為第二條(18S)亮度的兩倍，各組提取的R

10、NA完整性良好。
　　2.通過PARTEK分析軟件，組間對(duì)比差異分析，分別篩選出基因信號(hào)上調(diào)和下調(diào)2倍差異的全部基因。
　　2.1.淫羊藿苷組與對(duì)照組比較
　　2周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)23個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化。（10個(gè)基因上調(diào)，13個(gè)基因下調(diào)）
　　4周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)35個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化。（10個(gè)基因上調(diào)，25個(gè)基因下調(diào)）
　　2.2.CGF組與對(duì)照組比較
　　2周，篩選條件

11、2倍差異以上，共出現(xiàn)25個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化。（5個(gè)基因上調(diào)，20個(gè)基因下調(diào)）
　　4周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)40個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化。（17個(gè)基因上調(diào)，23個(gè)基因下調(diào)）
　　2.3.CGF組與淫羊藿苷組比較
　　2周，篩選條件2倍差異以上，共出現(xiàn)20個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化。（6個(gè)基因上調(diào)，14個(gè)基因下調(diào)）
　　4周，篩選條件2倍差異以上，出現(xiàn)個(gè)42基因表達(dá)發(fā)生變化。(5個(gè)基因上調(diào)，37個(gè)基因下調(diào))
　　3

12、.匯總出前5位上調(diào)與下調(diào)最顯著差異基因，并進(jìn)行組間比較。其中淫羊藿苷組與對(duì)照組比較在2周和4周都出現(xiàn)HGF基因高表達(dá);CGF組與對(duì)照組比較在2周和4周都出現(xiàn)Runx2基因高表達(dá);淫羊藿苷組與CGF組比較在2周時(shí)出現(xiàn)ZIC5基因高表達(dá)，但在4周時(shí)未見。
　　4.在Pathway分析中，差異基因共涉及了10條途徑，包括:蛋白消化和吸收（Protein digestion and absorption），5-羥色胺能神經(jīng)突觸（Serot

13、onergic synapse），ECM受體相互作用(ECM-receptorinteraction)，粘著(Focal adhesion)，腫瘤蛋白多糖化(Proteoglycansin cancer)，PI3K-Akt信號(hào)途徑(PI3K-Akt signaling pathway)，鈣離子信號(hào)途徑(Calcium signaling pathway)，擴(kuò)張型心肌病(Dilatedcardiomyopathy)，平滑肌收縮（Vascu

14、lar smooth muscle contraction）和神經(jīng)活性的配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptorinteraction)。
　　第三部分 淫羊藿苷及富自體濃縮生長因子促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路的探討
　　1.Real-time PCR檢測淫羊藿苷組與對(duì)照組HGF的mRNA表達(dá)
　　淫羊藿苷組與對(duì)照組樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增，

15、可見溶解曲線成單峰曲線，證明引物設(shè)計(jì)正確。進(jìn)行Real-time PCR分析。結(jié)果顯示，淫羊藿苷組HGF的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組。
　　2.Western blot檢測淫羊藿苷組與對(duì)照組HGF、p-Akt的蛋白的表達(dá)
　　提取淫羊藿苷組與對(duì)照組缺損區(qū)新生組織總蛋白進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示，淫羊藿昔組的HGF蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。淫羊藿苷組p-Akt的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。
　　3.Real-ti

16、me PCR檢測CGF組與對(duì)照組Runx2基因mRNA表達(dá)
　　CGF組與對(duì)照組樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，可見溶解曲線成單峰曲線，證明引物設(shè)計(jì)正確。進(jìn)行Real-time PCR分析。結(jié)果顯示，CGF組Runx2的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組。
　　4.Western blot檢測CGF組與對(duì)照組Runx2的蛋白的表達(dá)
　　提取CGF組與對(duì)照組缺損區(qū)新生組織總蛋白進(jìn)行Western

17、blot分析。結(jié)果顯示，CGF組Runx2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，CGF組ERK的磷酸化水平顯著高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.自體CGF與淫羊藿苷均能夠增加兔顱骨缺損區(qū)成骨骨量，提高愈合質(zhì)量。
　　2.自體CGF與淫羊藿苷均能促進(jìn)兔顱骨缺損愈合質(zhì)量與速度。
　　3.HGF因子與Runx2因子分別在淫羊藿苷組、CGF組2周、4周均有較顯著上調(diào)表達(dá)。
　　4.淫羊藿苷與CGF對(duì)顱骨缺損修復(fù)基因表達(dá)的影響