復合生長因子程序式釋放促進BMSCs成骨分化能力及骨缺損修復能力的研究.pdf

1、研究目的：骨折不愈合及骨缺損是臨床骨科醫(yī)生時常面對的棘手問題。骨組織工程技術的發(fā)展為解決這一問題帶來了希望。PRP和BMP-2均具有成骨能力，據(jù)報道相對于單個生長因子的單次釋放，多種生長因子的聯(lián)合以及有序釋放對于提高骨髓間充質干細胞的成骨分化及骨愈合均具有更強的促進作用。
　　 我們的實驗目的就是設計一種組織工程骨，該材料具備三維網(wǎng)狀結構，負載PRP和BMP-2，并且能夠精密控制其中生長因子的釋放動力學以適應成骨過程各階段對生長

2、因子種類和濃度的不同需求，進而促進骨缺損的修復。
　　 研究方法：
　　 1，活體取大鼠股骨骨髓，全骨髓法從骨髓中分離純化出BMSCs并加以傳代擴增，并鑒定其干細胞特征。
　　 2，Landerberg法制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，ELISA法檢測PRP和PPP中的生長因子濃度。
　　 3，采用復乳法(W/O/W)制備BMP-2/PLGA微球，電鏡下觀察微球外形；激光粒徑儀檢測微球

3、的粒徑大?。晃⑶騼菳MP-2包封率檢測；BMP-2微球一月內生長因子釋放曲線檢測。
　　 4，3D復合組織工程支架的構建，包括支架ⅠBMSCs/PPG；支架ⅡBMSCs/PRG；支架ⅢBMSCs/BMP/PPG；支架ⅣBMSCs/BMP/PRG；支架ⅤBMSCs/BMP-MPs/PPG；支架ⅥBMSCs/BMP-MPs/PRG。3D復合組織工程支架的電鏡檢測。支架中BMP-2緩釋曲線測量。
　　 5，BMSC在復合生物支

4、架中的三維培養(yǎng)，各復合組織工程支架中BMSCs增殖及成骨分化能力的檢測。
　　 6，動物分為四組，分別為空白對照組(Ⅰ)、PRP+BMSCs組(Ⅱ)、PRP+BMP-2+BMSCs組(Ⅲ)和PRP+BMP-2微球+BMSCs組(Ⅳ)，制作大鼠股骨中段骨缺損模型并植入組織工程骨材料。8周后取出股骨標本并檢測各組股骨骨痂直徑、生物力學強度、組織學檢測。
　　 7，統(tǒng)計學分析后得出結論。
　　 實驗結果：
　　

5、 1，全骨髓法分離純化的BMSCs經(jīng)鑒定為干細胞，連續(xù)培養(yǎng)8代后干細胞生物學性狀無改變，細胞生長呈典型的干細胞特征。成骨誘導培養(yǎng)后堿性磷酸酶(ALP)染色陽性，茜素紅S染色陽性，VonKossa染色陽性，成軟骨誘導分化后甲苯胺藍染色陽性，流式細胞術檢測成骨細胞表型和骨髓間充質干細胞一致。
　　 2，PRP和PPP經(jīng)激活后呈膠凍狀，電鏡下呈三維網(wǎng)狀結構，孔徑大小為50～100μm，孔徑率為90％。血小板計數(shù)在PRP中為1.2±0.

6、1×109/ml、在PPP中為8±0.5×106/ml。PRP中TGF-β1含量為450.5±21.4ng/ml。PDGF-AB含量為85.8±13.2ng/ml。
　　 3，采用復乳法制備的BMP-2微球，平均粒徑為9.86μm，包封率76％，突釋率35％，30天總釋放為83％左右的藥量。
　　 4，在包含PRP的Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ組中，BMSCs的增殖速度明顯快于對照組，而在包含PPP的Ⅲ、Ⅴ組中，BMSCs的增殖速度相對于

7、對照組并不顯著；相對于PRP，BMP-2+PRP聯(lián)合并未能顯著促進BMSCs的增殖；相對于BMP-2+PRP，BMP-2/MPs+PRP并未能顯著促進BMSCs的增殖。
　　 5，體外培養(yǎng)14天時，BMSCs成骨分化的早期指標堿性磷酸酶(ALP)表達水平在包含BMP-2+PRP的組Ⅳ，Ⅵ達到最高水平；BMSCs成骨分化的后期指標骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)在包含BMP-2+PRP的組中表達量高于單獨包含BMP-2或PRP

8、的組，而其表達量在BMP-2/MPs+PRP組中最高。
　　 6，制作股骨中段骨缺損模型并植入組織工程骨材料后8周，生物力學強度、骨折愈合影像學評分、骨痂直徑測量及骨痂組織學評分均為PRP+BMP-2微球+BMSCs組最高，PRP+BMP-2+BMSCs組次之。
　　 實驗結論：
　　 1，PRP中豐富的復合生長因子能夠有效刺激BMSCs的增殖；PRP中復合生長因子和BMP-2協(xié)同釋放能夠有效刺激BMSCs的增殖