多效生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在椎間盤中的表達(dá)及意義的研究.pdf

1、目的：椎間盤退變(IVDD)是指椎間盤失去正常結(jié)構(gòu)并伴有進(jìn)行性纖維化，表現(xiàn)為凝膠樣髓核消失，髓核與纖維環(huán)原有清晰界限逐漸消失，纖維環(huán)板層粗糙和纖維化，最后出現(xiàn)裂隙及老年色素沉積。研究證實(shí)椎間盤的退變與椎間盤組織中酶系活性的改變和某些細(xì)胞因子的釋放有關(guān)。多效生長(zhǎng)因子(PTN)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管生成的重要刺激因子，在椎間盤退變中的作用仍不十分清楚，本文研究不同月齡Wistar大鼠腰椎間盤形態(tài)學(xué)變化規(guī)律和其中PTN及VE

2、GF含量的變化情況，以闡明生理狀態(tài)下大鼠腰椎間盤中PTN及VEGF表達(dá)的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步探討PTN及VEGF與腰椎間盤退變的關(guān)系。 方法：⑴健康Wistar大鼠共50只，雄性，體重不限，以月齡為單位，分為1、3、6、12和18，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只。以25g/L戊巴比妥鈉腹腔過量麻醉處死大鼠，每只大鼠取第4、5腰椎間盤組織標(biāo)本。第5腰椎間盤標(biāo)本取出后經(jīng)4％多聚甲醛溶液固定，10％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣，石蠟包埋，4μ

3、m連續(xù)切片；第4腰椎間盤標(biāo)本置于—70℃冰箱保存。⑵二甲苯脫蠟→梯度酒精水化→蘇木精—伊紅染色→梯度酒精脫水→二甲苯透明→樹膠封片。⑶脫蠟水化→3％過氧化氫(H2O2)抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性→熱抗原修復(fù)→BSA封閉→一抗、二抗孵育→滴加SABC試劑→DAB顯色→核復(fù)染→1％鹽酸酒精分化→脫水透明→樹膠封片；同時(shí)選用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。⑷將組織碾碎→超聲勻漿、離心，提取蛋白，蛋白定量，加樣→SDS-PAGE凝膠電

4、泳→轉(zhuǎn)膜→封閉、洗滌后在一抗溶液中4℃浸泡過夜→二抗溶液中室溫下浸泡2小時(shí)→洗滌液洗膜后染色至條帶呈現(xiàn)，終止染色。同時(shí)選用β—actin作內(nèi)參，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。 結(jié)果：①隨著大鼠月齡的增加，椎間盤組織結(jié)構(gòu)紊亂的程度逐漸加重，髓核內(nèi)基質(zhì)降解、正中出現(xiàn)空腔，膠原纖維增生、粗大、排列紊亂、并可見纖維斷裂或缺失。②隨著大鼠月齡的增加(1—12月齡)，椎間盤組織細(xì)胞中PTN及VEGF的表達(dá)有逐漸減低的趨勢(shì)，但至18月齡，PTN

5、及VEGF的表達(dá)又有所增加；6和12月齡組椎間盤細(xì)胞中PTN及VEGF的表達(dá)顯著低于1月齡組(P<0.01)，而18月齡組PTN及VEGF的表達(dá)顯著高于12月齡組(P<0.01)。同月齡組椎間盤細(xì)胞中，PTN及VEGF在終板的表達(dá)高于在髓核和纖維環(huán)中的表達(dá)(P<0.05)，髓核和纖維環(huán)中PTN及VEGF的表達(dá)未見明顯差異(P>0.05)。部分標(biāo)本細(xì)胞外基質(zhì)中也可見PTN及VEGF陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論：⑴大鼠椎間盤組織結(jié)構(gòu)隨著月齡增加