慢病毒轉(zhuǎn)染手冊

1、慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力?；靖攀雎《据d體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究

2、，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。慢病毒的應用目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達siRNA的載體然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達載體的細胞

3、中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶polyA尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個U。U6和H1RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)

4、構(gòu)（stemloop）。在siRNA表達載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNAshRNA)載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個U3’突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)進一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從

5、中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。慢病毒載體感染細胞類型感染分裂和不分裂細胞感染分裂和不分裂細胞感染分裂細胞，但在干細胞中表達效率低表達豐度高水平表達高水平表達高水平表達表達時間快（12天）慢（24天）快（12天）滴度滴度高達1012pfuml最高可達109－10TUml最高可達109－10TUml克隆容量可插入高達8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降

6、低可插入不超過6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性動物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，效率達50以上可以，但很難啟動子可以更換特異性啟動子可以更換特異性啟動子不需要啟動子能否用于MIRCNA可以可以不可以能否用于四環(huán)素誘導不可以TETONTETOFF不可以系統(tǒng)的目的與意義●對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為