重組腺病毒介導(dǎo)人TIMP-1基因抑制肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 肝癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解是導(dǎo)致肝癌生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的重要因素，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)在此過程中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建攜帶人TIMP-1全長cDNA的重組腺病毒AdhTIMP-1，作用于人肝癌細(xì)胞株以及肝癌地位模型，探討其抑制人肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。 方法從人肝細(xì)胞癌(HCC)組織中提取總：RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)合成人基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

2、(hTIMP-1)全長cDNA。測序正確后將其正向克隆到腺病毒載體．AdEasy<'TM>系統(tǒng)中穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV的多克隆位點(diǎn)(MCS)，與骨架質(zhì)粒。pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝生成攜帶人TIMP-1的重組腺病毒AdhTIMP-1。用感染復(fù)數(shù)(MOI)為100的AdhTIMP-1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株(HepG2)：PCR鑒定重組病毒；熒光計(jì)數(shù)測定重組病毒滴度；Western B

3、lot檢測培養(yǎng)液上清中TIM-1蛋白的表達(dá)；半定量RT-PCR．檢測TIMP-1 mRNA在不同培養(yǎng)時(shí)相下的表達(dá)；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；MTT實(shí)驗(yàn)及生長曲線監(jiān)測細(xì)胞的生長和增殖；Boyden Chamber檢測細(xì)胞體外侵襲人工基底膜(Matrigel)的能力；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察AdhTIMP-1對(duì)裸鼠移植性HCC的影響以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用；抗CD34單克隆抗體檢測腫瘤組織中微血管密度(MVD)判斷微血管對(duì)腫瘤惡性進(jìn)程的影響。

4、 結(jié)果 構(gòu)建攜帶人TIMP-1全長cDNA的重組腺病毒AdhTIMP-1，滴度達(dá)1×10<'10>efu／ml。AdhTIMP-1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，Western Blot可以檢測到TIMP-1蛋白的表達(dá)；RT-PCR可以檢測到TIMP-1mRNA，并在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，可用于進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AdhTIMP-1轉(zhuǎn)染的HepG2穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)下降91.6％，對(duì)HepG2體外侵襲力有明顯的影響；MTT及生長曲

5、線提示轉(zhuǎn)染AdhTIMP-1的HepG2生長和增殖受到了明顯抑制；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，AdhTIMP-1對(duì)HCC的生長以及肺轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，腫瘤內(nèi)MVD亦明顯減小。 結(jié)論 成功構(gòu)建攜帶人TIMP-1全長cDNA的重組腺病毒AdhTIMP-1，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)該病毒載體能夠穩(wěn)定高效地表達(dá)TIMP-1。TIMP-1可能通過抑制MMPs作用，減少M(fèi)atrigel中ECM成分的降解，從而降低HCC的侵襲力。TTMP-1基因可能通