條件復(fù)制型腺病毒介導(dǎo)的自殺基因（CD和HSV-1TK）轉(zhuǎn)移抑制體內(nèi)外腫瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子調(diào)控復(fù)制、分別攜帶自殺基因CD或HSV-1TK的新型腺病毒載體,觀察該病毒載體在端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力,并進(jìn)一步深入研究該載體與自殺基因/前藥系統(tǒng)(CD/5-FC,HSV-1TK/GCV)結(jié)合后,在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤的殺傷作用.為腫瘤基因治療提供一個(gè)新的方法. 方法：在人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子調(diào)控E1A表達(dá)的條件復(fù)制型腺病毒載體的基礎(chǔ)上,分離CD及HSV-1TK基因表達(dá)盒,并插

2、入上述條件復(fù)制型腺病毒載體的E1A基因表達(dá)盒下游,構(gòu)建兩個(gè)新的條件復(fù)制型腺病毒載體Ad.hTERT-E1A-CD和Ad.hTERT-E1A-TK.通過(guò)與腺病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞 (HEK293)后,成功包裝出重組腺病毒顆粒.然后經(jīng)過(guò)篩選、擴(kuò)增和密度梯度離心,制備出純化的腺病毒.并以野生型腺病毒d1309和復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.GFP作為對(duì)照,對(duì)該病毒在端粒酶活性很低或陰性的原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和端粒酶活性很高或陽(yáng)性的腫瘤

3、細(xì)胞(包括NCIH460、HeLa、SW1990)中的復(fù)制能力進(jìn)行了觀察.并通過(guò)CCK-8顯色評(píng)估Ad.hTERT-E1A-CD和Ad.hTET-E1A-TK本身,或聯(lián)合CD/5-FC、HSV-1TK/GCV自殺基因/前藥系統(tǒng)后,對(duì)體外培養(yǎng)的NCIH460、A549和HeLa等腫瘤細(xì)胞的殺傷效果.然后,建立人肺癌裸鼠模型,進(jìn)一步研究病毒結(jié)合自殺基因/前藥系統(tǒng)在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用. 結(jié)果： 1.重組腺病毒載體在正

4、常和腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制情況Ad.hTERT-EIA-CD及Ad.hTERT-EIA-TK能選擇性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,復(fù)制效率與d1309類似,而在正常的原代成纖維細(xì)胞中不復(fù)制. 2.體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)(1)Ad.hTERT-ElA-CD治療組: Ad.hTERT-ElA-CD單獨(dú)使用,或與CD/5-FC自殺基因/前藥系統(tǒng)聯(lián)合后,NCIH460細(xì)胞的存活率分別為20.15﹪和1.24﹪；A549細(xì)胞的存活率分別為30.13﹪

5、和1.65﹪；HeLa細(xì)胞的存活率分別為15.43﹪和0.54﹪.(2)Ad.TERT-EIA-TK治療組:Ad.TERT-ElA-TK、單獨(dú)使用,或與HSV-lTK/GCV自殺基因/前藥系統(tǒng)聯(lián)合后,NCIH460細(xì)胞的存活率分別為31.12﹪和1.81﹪；A549細(xì)胞的存活率分別為25.43﹪和2.24﹪；HeLa細(xì)胞的存活率分別為15.87﹪和0.94﹪. 以上結(jié)果表明,Ad.hTERT-EIA-CD和Ad.hTERT-E

6、1A-TK對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用,CD/5-FC和HSV-1TK/GCV自殺基因/前藥系統(tǒng)增加了病毒殺傷腫瘤細(xì)胞的效果.(1).Ad.hTERT-E1A-CD治療情況腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示:從治療開(kāi)始后的第8天起,單獨(dú)注射Ad.hTERT-E1A-CD組,Ad.hTERT-EIA-CD與5-FC聯(lián)合治療組,與PBS、PBS+5-FC及Ad.null組相比,腫瘤生長(zhǎng)減慢.其中Ad.hTERT-E1A-CD與5-FC聯(lián)合組,腫瘤生長(zhǎng)更趨緩慢.

7、 治療結(jié)束時(shí),PBS、PBS+5-FC、Ad.null、Ad.hTERT-E1A-CD、Ad.hTERT-EIA-CD與5-FC聯(lián)合治療組,裸鼠移植瘤體積分別為:2488.80±468.97mm<'3>、2261.00±362.87mm<'3>、 2440.00±227.99mm<'3>、993.01±317.62mm<'3>、326.80±236.66mm<'3>.統(tǒng)計(jì)分析揭示,單獨(dú)注射Ad.hTERT-EIA-CD組,Ad.hT

8、ERT-EIA-CD與5-FC聯(lián)合應(yīng)用組,與僅注射PBS的對(duì)照組比較,裸鼠移植瘤體積明顯較小(p=0.006:p=0.001).而單獨(dú)注射復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.null組,與腹腔注射前藥5-FC組或PBS的對(duì)照組相比較,裸鼠移植瘤體積差異不明顯(p=1.000:p=0.995).Ad.hTERT-EIA-CD聯(lián)合5-FC組與單獨(dú)注射Ad.hTERT-E1A-CD組相比,裸鼠移植瘤體積更小(p=0.032). 處死小鼠后剝離腫瘤

9、,稱取腫瘤的重量.與PBS組比較,Ad.hTERT-E1A-CD與5-FC聯(lián)合治療組及Ad.hTERT-EIA-CD單獨(dú)治療組,腫瘤抑制率分別為80.5﹪和57.6﹪.Ad.hTERT-E1A-CD聯(lián)合5-FC治療組和單獨(dú)注射Ad.hTERT-EIA-CD治療組相比,腫瘤抑制率達(dá)54.1﹪.病理切片發(fā)現(xiàn)腫瘤經(jīng)過(guò)Ad.hTERT-E1A-CD治療后,腫瘤內(nèi)有廣泛的壞死,尤其與CD/5-FC聯(lián)合使用后,壞死區(qū)域更加廣泛.對(duì)照組病理切片無(wú)明顯

10、壞死區(qū)域.(2) Ad.hTERT-E1A-TK治療情況腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示:從治療開(kāi)始后的第8天起,單獨(dú)注射Ad.hTERT-EIA-TK以及Ad.hTERT-EIA-TK與GCV聯(lián)合治療組,與對(duì)照組相比,腫瘤生長(zhǎng)減慢.第16天時(shí),Ad.hTERT-E1A-TK與GCV聯(lián)合治療組,腫瘤生長(zhǎng)比Ad.hTERT-E1A-TK組更趨緩慢. 治療結(jié)束時(shí),PBS+GCV、Ad.hTERT-E1A-TK、Ad.hTERT-EIA-TK與GC

11、V聯(lián)合治療組,腫瘤體積分別為:2287.00±399.24mm<'3>、1274.50±325.47mm<'3>和435.01±34.16mm<'3>.單獨(dú)用Ad.hTERT-E1A-TK以及Ad.hTERT-EIA-TK與GCV聯(lián)合組,與對(duì)照組比較,裸鼠腫瘤體積明顯較dx(p=0.025；p=0.008).其中,Ad.hTERT-E1A-TK聯(lián)合GCV治療組與Ad.hTERT-E1A-TK單獨(dú)治療組相比腫瘤體積更小(p=0.040).

12、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠,剝離腫瘤后稱取瘤重.與對(duì)照組比較,Ad.hTERT-E1A-TK與GCV聯(lián)合治療組和Ad.hTERT-E1A-TK單獨(dú)治療組,腫瘤抑制率為74.34﹪和154.39﹪.mAd.hTERT-E1A-TK聯(lián)合GCV治療組與單獨(dú)注射Ad.hTERT-E1A-TK相比,腫瘤抑制率達(dá)43.75﹪.提示復(fù)制型腺病毒Ad.hTERT-E1A-TK單獨(dú)使用就產(chǎn)生了明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用,當(dāng)與前藥GCV聯(lián)合使用后,抑制腫瘤

13、生長(zhǎng)的作用明顯增強(qiáng).結(jié)論:我們成功的構(gòu)建了由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子調(diào)控的、可介導(dǎo)自殺基因CD或HSV-1TK轉(zhuǎn)移和表達(dá)的復(fù)制型腺病毒載體Ad.hTERT-ElA-CD及Ad.hTERT-ElA-TK.該病毒可以在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制,并殺傷腫瘤細(xì)胞,而在端粒酶陰性的原代成纖維細(xì)胞中不復(fù)制,具有很好的腫瘤細(xì)胞選擇性.體內(nèi)外試驗(yàn)表明,當(dāng)病毒與CD/5-FC或HSV-lTK/GCV自殺基因/前藥系統(tǒng)結(jié)合時(shí),殺傷腫瘤細(xì)胞的能力得到提高