腺病毒介導(dǎo)的靶向性Akt1和COX-2shRNA抑制SGC-7901人胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:研究腺病毒介導(dǎo)的靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體rAd5-Akt1+COX-2(rAd5-A+C)在體內(nèi)外對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901生長(zhǎng)的抑制效果和探討其可能的機(jī)制。
　　 方法:將腺病毒載體rAd5-A+C體外轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901后,熒光顯微鏡下觀察腺病毒rAd5-A+C的轉(zhuǎn)染效率,Real-time PCR和Western blot

2、分別檢測(cè)對(duì)照組SGC-7901、空載組rAd5-HK和治療組tAd5-A+C中Akt1和COX-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；同時(shí)利用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)及凋亡的抑制指標(biāo)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平；噻唑藍(lán)比色分析法(MTT法)和流式細(xì)胞法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞的增殖活性。裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)一步觀察rAd

3、5-A+C對(duì)胃腺癌SGC-7901生長(zhǎng)的抑制效果,并應(yīng)用免疫組化檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白Akt1、COX-2、Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表達(dá)水平；TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞的原位凋亡。
　　 結(jié)果:將腺病毒rAd5-A+C體外轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞株SGC-790124h后,熒光顯微鏡下觀察到腺病毒rAd5-A+C有很高的轉(zhuǎn)染效率,可達(dá)90％以上。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示治療組rAd5-A+

4、C的Akt1和COX-2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào),其ACt值分別是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比空載組rAd5-HK(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和對(duì)照組SGC-7901(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高,而空載組和對(duì)照組之間ΔCt值無明顯變化。同時(shí)治療組的Akt1和COX-2蛋白表達(dá)量與空載組和對(duì)照組相比分別下調(diào)70.5％和63.7％,空載組和對(duì)照組相比Akt1和COX-2蛋白表

5、達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且與胃癌生長(zhǎng)相關(guān)的指標(biāo)Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的蛋白表達(dá)水平也明顯下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)MTT法顯示與對(duì)照組SGC-7901和空載組rAd5-HK相比較,治療組rAd5-A+C的胃癌細(xì)胞在治療24h后增殖活性明顯被抑制；而細(xì)胞周期分析顯示rAd5-A+C治療組進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)減少了13.4％和14.7％,而進(jìn)入G0/G1期的細(xì)胞增加了18.3％和17.3％,細(xì)胞阻滯在G0/G1期。體內(nèi)裸

6、鼠皮下荷瘤模型顯示rAd5-A+C可抑制腫瘤的生長(zhǎng)；免疫組化法檢測(cè)腫瘤標(biāo)本的相關(guān)蛋白表達(dá)情況顯示,治療組rAd5-A+C的Akt1、COX-2、Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2表達(dá)水平均有明顯下調(diào),且rAd5-A+C可誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞的原位凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.介導(dǎo)靶向性Akt1和COX-2 shRNA的腺病毒載體rAd5-A+C轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞株SGC-790124h后有很高的轉(zhuǎn)染效

7、率。
　　 2.在體外實(shí)驗(yàn)中腺病毒載體rAd5-A+C轉(zhuǎn)染后可明顯敲低胃腺癌癌細(xì)胞SGC-7901中Aktl和COX-2的表達(dá),并進(jìn)而下調(diào)與胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的指標(biāo)Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表達(dá)。腺病毒載體rAd5-A+C通過下調(diào)Akt1和COX-2的表達(dá)能明顯抑制胃腺癌細(xì)胞增殖和血管生成,阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　 3.裸鼠皮下移植瘤模型顯示:腺病毒載體rAd5-

8、A+C同樣能抑制胃腺癌組織中Akt1和COX-2的表達(dá)及下調(diào)與胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)；腺病毒載體rAd5-A+C通過下調(diào)Akt1和COX-2的表達(dá)也能明顯抑制胃腺癌的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)胃腺癌組織細(xì)胞的凋亡,且與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；
　　 4.腺病毒載體rAd5-A+C通過下調(diào)Akt1和COX-2的表達(dá)來抑制胃腺癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)的機(jī)制可能與下調(diào)Ki-67、VEGF、C