腺病毒介導(dǎo)的Rb94基因聯(lián)合γ-輻射抑制人惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的研究.pdf

1、人Rb基因(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因Retinoblastoma gene)是最早克隆出來(lái)的人類腫瘤抑制基因<'[1][2][3]>，Rb94基因是Rb基因的一部分，野生型pRb110蛋白N端缺失112個(gè)氨基酸殘基即為pRb94蛋白。有研究表明Rb94基因有比Rb基因更好的抑瘤效應(yīng)。本研究目的是采用INVITROGEN的pENTR<'TM>1A質(zhì)粒、表達(dá)載體pAd/CMV/V5-DEST<'TM>構(gòu)建含有Rb94基因的重組腺病毒表達(dá)載體(Ad

2、-Rb94)，并觀察驗(yàn)證其抑瘤效應(yīng)。 基因治療是當(dāng)前腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)，也是以后腫瘤治療的發(fā)展趨勢(shì)。但因其尚無(wú)突破性進(jìn)展，還存在許多未能解決的問(wèn)題，所以不能單獨(dú)作為腫瘤治療的一種手段。而放療是目前腫瘤治療的主要方法，從機(jī)理上分析，放療和基因治療兩者之間存在著相互增強(qiáng)的作用。用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的含Rb基因的重組腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染惡性腫瘤細(xì)胞，然后聯(lián)合γ-輻射，研究?jī)烧吖餐淖饔茫瑸榕R床惡性腫瘤的基因治療和放療的聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 本研究通過(guò)人的胚胎組織提取總RNA，然后利用特異引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以它為模板使用高保真DNA聚合酶采用PCR技術(shù)得到我們所需要的平末端的目的基因片段。再利用INVITROGEN的pENTR<'TM>1A質(zhì)粒，經(jīng)EcoRV、Xmn Ⅱ平末端酶切，酶切后和擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大量提取質(zhì)粒。用所提取的質(zhì)粒和腺病毒表達(dá)載體進(jìn)行LR重組構(gòu)建含目的基因的腺病毒表達(dá)載體。并把所構(gòu)建的腺病毒表達(dá)載體用Pac Ⅰ進(jìn)行酶切

4、后，在脂質(zhì)體的作用下轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。從而制備含有目的基因的腺病毒顆粒。本實(shí)驗(yàn)選擇了食管癌和乳腺癌兩株細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡變化情況。同時(shí)腫瘤細(xì)胞用重組腺病毒轉(zhuǎn)染后再聯(lián)合γ-輻射進(jìn)行觀察，觀察聯(lián)合作用后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化情況。 從我們所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，擴(kuò)增的目的片段經(jīng)電泳鑒定與預(yù)期相符。構(gòu)建的pENTR<'TM>1A質(zhì)粒經(jīng)MS Ⅱ和Nhe Ⅰ酶切鑒定連接方向

5、正確。構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)載體經(jīng)PCR鑒定含有目的Rb94基因。用所得的重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染食管癌腫瘤細(xì)胞后，通過(guò)研究其生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期的變化情況可知，腺病毒顆粒攜帶的目的基因可有效的抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，通過(guò)其生長(zhǎng)曲線的變化發(fā)現(xiàn)Rb94基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞也有一定的抑制作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可知，用重組的含Rb94基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后再聯(lián)合γ-輻射比任何單一的處理方法效果要好。我們所構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)載體含有目的