腺病毒介導(dǎo)的TK-GCV基因系統(tǒng)聯(lián)合腫瘤壞死因子-α治療膀胱癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 膀胱癌是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，世界上每年診斷的膀胱癌超過(guò)二十萬(wàn)例，每年約有一萬(wàn)兩千人死于膀胱癌。在美國(guó)，為第4位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)，發(fā)病率位于泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的第一位。膀胱癌90％以上為移行上皮細(xì)胞癌(transitionalcellcarcinomaofthebladder，TCC)，對(duì)放療、化療敏感性不高，治療以手術(shù)為主，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，尤其是晚期腫瘤及有耐藥性的

2、原位膀胱癌，5年復(fù)發(fā)率約60％，15年復(fù)發(fā)率可達(dá)88％，其中10％-30％的復(fù)發(fā)腫瘤進(jìn)展為浸潤(rùn)型，遠(yuǎn)期療效不佳。特別是表淺性膀胱癌經(jīng)尿道切除后的高復(fù)發(fā)率已經(jīng)成為了治療中亟待解決的問(wèn)題。目前認(rèn)為膀胱癌術(shù)后輔助治療是治療的關(guān)鍵，隨著自殺基因(suicidegene)系統(tǒng)對(duì)膀胱癌治療研究的逐步深入，大家逐漸認(rèn)識(shí)到自殺基因系統(tǒng)是一種發(fā)展前景良好的治療方法，TK/GCV系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的自殺基因系統(tǒng)之一，TK/GCV通過(guò)表達(dá)胸苷激酶將無(wú)毒前藥

3、如丙氧鳥(niǎo)苷(ganciclovirGCV)磷酸化，作用于分裂期細(xì)胞，作為其底物摻入細(xì)胞DNA合成鏈并抑制細(xì)胞DNA聚合酶，使細(xì)胞DNA合成終止從而殺死細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒介導(dǎo)TK/GCV自殺基因系統(tǒng)進(jìn)行各種腫瘤的治療研究，作用效果明顯。但是目前自殺基因系統(tǒng)存在著如基因轉(zhuǎn)染效率低下，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性差，各類載體及自殺基因本身對(duì)機(jī)體的毒性和損傷作用，載體及腫瘤細(xì)胞殺死后引發(fā)的自身免疫反應(yīng)，前體藥物代謝產(chǎn)物僅僅針對(duì)分裂

4、期細(xì)胞等局限性。為了彌補(bǔ)自殺基因治療系統(tǒng)的不足，越來(lái)越多的學(xué)者都在研究將現(xiàn)有的治療方法和自殺基因治療系統(tǒng)相結(jié)合，以尋找對(duì)抗膀胱癌復(fù)發(fā)的新思路和新途徑。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，尤其是對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有直接及間接的抑制和殺傷作用。在體外本身高濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用具有直接殺傷作用外，較低濃度時(shí)它能夠通過(guò)誘導(dǎo)非增殖期細(xì)胞的凋亡而達(dá)到殺傷作用。在體內(nèi)通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細(xì)胞因子(IL-1，I

5、L-2，IFN-γ)增強(qiáng)免疫效應(yīng)，并增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)能誘導(dǎo)腫瘤局部炎癥反應(yīng)，引起血液凝固局部組織缺血壞死等機(jī)制引起腫瘤壞死。 TK/GCV基因系統(tǒng)聯(lián)合TNF-α治療膀胱癌的方法目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用TK/GCV系統(tǒng)聯(lián)合小劑量TNF-α對(duì)鼠膀胱癌MB49細(xì)胞進(jìn)行治療，并對(duì)其體外、體內(nèi)殺傷作用進(jìn)行比較，探討二者聯(lián)合應(yīng)用的治療效果，為自殺基因聯(lián)合細(xì)胞因子治療膀胱癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

6、方法： 1、體外培養(yǎng)HEK293細(xì)胞及MB49細(xì)胞。 2、使用含TK基因和綠色熒光蛋白(greenfluorscentprotein，GFP)基因的復(fù)制缺陷腺病毒(AdCMV-TK，Adv+)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，擴(kuò)增腺病毒。超速離心純化腺病毒，用綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定腺病毒滴度。 3、腺病毒感染膀胱癌MB49細(xì)胞，獲取轉(zhuǎn)染TK基因的MB49細(xì)胞。分別提取膀胱癌MB49細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染TK基因MB49細(xì)胞RNA，進(jìn)行

7、RT-PCR反應(yīng)，電泳鑒定。 4、在體外培養(yǎng)的已轉(zhuǎn)染TK基因的MB49細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的GCV，GCV濃度為0、5、10、12.5、25、50、75、100、125μg/ml。在體外培養(yǎng)的MB49細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNF-α，TNF-α濃度為0、2.5、5、10、20、25、50、80、100μg/ml。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定藥物作用細(xì)胞72h后細(xì)胞存活率，確定GCV及TNF-α的有效作用

8、濃度。 5、根據(jù)以前的試驗(yàn)結(jié)果及前述實(shí)驗(yàn)所得GCV及TNF-α的有效作用濃度，選擇對(duì)MB49細(xì)胞殺傷作用較小的藥物濃度梯度(GCV取0、5、10、25、50μg/ml濃度，TNF-α取0、5、20μg/ml)分別加入GCV、GCV+TNF-α組作用已轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細(xì)胞，以正常MB49細(xì)胞為空白對(duì)照。采用MTT法測(cè)定各治療組藥物作用轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞72h細(xì)胞殺傷率。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)TK/GCV、TNF-α、TK/GCV

9、+TNF-α組作用8h后細(xì)胞凋亡情況。 6、雌性C57BL/6小鼠30只，皮下注射濃度為1×107/mlMB49細(xì)胞PBS懸液0.1ml，2周后選取腫瘤大小約100mm3鼠24只，隨機(jī)分成4組，每組6只，第1組為對(duì)照組：MB49(注射PBS)：第2組為T(mén)NF-α組：MB49/TNF-α；第3組為腺病毒加GCV治療組(TK/GCV)：MB49/(TK/GCV)；第4組為聯(lián)合治療組：MB49/(TK/GCV+TNF-α)。第3、4組

10、分別進(jìn)行瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射腺病毒，每次100μl，每天1次，連續(xù)3d，第1、2組僅在瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射PBS每次100μl，每天1次，連續(xù)3d。從第4天開(kāi)始，第2、4組在瘤體周圍皮下浸潤(rùn)注射濃度為100μg/mlTNF-α100μl，第3、4組腹腔內(nèi)注射GCV100mg.kg-1第1組腹腔內(nèi)及瘤體周圍皮下分別注射PBS各在100μl，連續(xù)10d。之后再觀察2d結(jié)束實(shí)驗(yàn)，測(cè)量各鼠腫瘤體積大小，并取出各組鼠腫瘤進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 7、實(shí)驗(yàn)

11、數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(單向方差分析One-WayANOVA及析因分析)，以P≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、293細(xì)胞能大量擴(kuò)增腺病毒，純化后腺病毒滴度為2×109PFU/ml。 2、經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增己轉(zhuǎn)染腺病毒的MB49細(xì)胞出現(xiàn)大小為234bp的TK基因片段，而未轉(zhuǎn)染腺病毒的MB49細(xì)胞未擴(kuò)增出相應(yīng)片段，表明感染腺病毒的MB49細(xì)胞有TK基因mRNA表達(dá)。

12、 3、GCV作用72小時(shí)后轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細(xì)胞存活率隨著GCV濃度的增高逐漸降低：GCV濃度為5μg/ml、25μg/ml、125μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率分別平均為(96.97±1.67)％、(80.82±0.64)％、(28.15±1.61)％；TNF-α作用MB49細(xì)胞72小時(shí)后，細(xì)胞存活率隨著TNF-α濃度增高而逐漸降低，TNF-α濃度為2.5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml細(xì)胞存活率分別為(91.26±0.37)

13、％、(54.69±2.63)％、(14.69±1.51)％。GCV對(duì)轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細(xì)胞及TNF-α對(duì)MB49細(xì)胞均有良好的抑制生長(zhǎng)作用，且抑制作用的呈濃度依賴性。 4、低濃度TNF-α聯(lián)合時(shí)各個(gè)濃度GCV對(duì)細(xì)胞的殺傷率均較同濃度下單純GCV對(duì)細(xì)胞的殺傷率有明顯增強(qiáng)，且隨TNF-α濃度增高聯(lián)合治療組殺傷效率增強(qiáng)。聯(lián)合治療組較單獨(dú)應(yīng)用TNF-α或GCV組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P=0.00)，作用轉(zhuǎn)染腺病毒MB49細(xì)胞72h后，單純50

14、μg/mlGCV組殺傷率僅為(24.39±1.10)％，而50μg/mlGCV+5μg/mlTNF-α組及50μg/mlGCV+20μg/mlTNF-α組殺傷率分別為(40.05±0.97)％、(65.47±0.67)％，說(shuō)明低濃度TNF-α能明顯增強(qiáng)GCV對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)TK/GCV、TNF-α、TK/GCV+TNF-α組細(xì)胞均出現(xiàn)典型的sub-G1期凋亡峰，聯(lián)合作用組凋亡率達(dá)(12.99±0.09)％較單獨(dú)用藥組(T

15、K/GCV組為(6.66±0.13)％、TNF-α組為(7.76±0.12)％)有明顯提高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P=0.000)。說(shuō)明TK/GCV、TNF-α均能有效誘導(dǎo)凋亡，且二者均有協(xié)同作用。 5、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組鼠腫瘤體積為171.52±4.33mm3，單用TK/GCV、TNF-α組的腫瘤體積分別為93.43±2.10mm3、53.95±2.61mm3，這兩組體積明顯小于對(duì)照組(P=0.000)。而聯(lián)合治療組腫瘤體積為

16、18.23±1.11mm3，明顯小于前面3組(P=0.000)。 6、組織病理學(xué)HE染色見(jiàn)各治療組均出現(xiàn)細(xì)胞壞死凋亡，聯(lián)合應(yīng)用組較單獨(dú)應(yīng)用自殺基因及細(xì)胞因子效果好，僅于周邊見(jiàn)少量活腫瘤細(xì)胞。 結(jié)論： 1、腺病毒載體能有效地將TK基因?qū)氚螂装㎝B49細(xì)胞中表達(dá)； 2、丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)對(duì)轉(zhuǎn)染TK基因的鼠膀觥癌MB49細(xì)胞能有效地殺傷，有劑量依賴關(guān)系； 3、TNF-α在體外對(duì)鼠膀胱癌MB49細(xì)胞進(jìn)有