腺病毒介導(dǎo)的CD-TK融合基因聯(lián)合GCV和-或5-Fc對(duì)人膀胱癌的治療作用.pdf

1、研究背景：膀胱移行細(xì)胞癌(transitional-celltumorTCC)是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。其發(fā)生率在人體腫瘤發(fā)生率中男性為第4位，女性為第8位。美國(guó)每年新增膀胱癌患者約50.000人。膀胱癌在診斷時(shí)有75-80％為未侵犯膀胱肌層的表淺性TCC。表淺性TCC首選采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TURBt)進(jìn)行治療。若僅行電切術(shù)，其術(shù)后有50％-70％患者將在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)腫瘤中10％-15％會(huì)向膀胱肌層浸潤(rùn)發(fā)展成為浸潤(rùn)性TC

2、C。30％浸潤(rùn)性TCC患者將在2年內(nèi)死亡。 為預(yù)防表淺性TCC電切術(shù)后復(fù)發(fā)，術(shù)后進(jìn)行膀胱內(nèi)灌注絲裂霉素、卡介苗等藥物是最簡(jiǎn)單、有效且常用的一種方法。灌注治療后，表淺性TCC電切術(shù)后復(fù)發(fā)率可以下降20％左右，但復(fù)發(fā)率仍有30％-50％，且不論采取何種預(yù)防治療措施，10-15％向膀胱肌層浸潤(rùn)發(fā)生率不會(huì)改變。因此臨床上渴望有新的治療措施來(lái)更有效的治療TCC。 基因治療的出現(xiàn)與發(fā)展，為人們最終戰(zhàn)勝TCC帶來(lái)了希望。在腫瘤基因治療

3、諸多策略中，向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入“自殺基因(suicidegene)”并激活腫瘤細(xì)胞自殺的治療策略倍受重視。 單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus，HSV)胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)基因(HSV-TK基因)和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(E.colicytocinedeaminase，CD)基因是最常用的兩種自殺基因。若能將HSV-TK基因或CD基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中并使之有效地表達(dá)，就可以用丙氧鳥(niǎo)苷(ganc

4、iclovirGCV)、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(acyclovirACV)或5-氟胞嘧啶(5-flurocytosine5-Fc)直接殺傷腫瘤。用該類基因治療腫瘤還存在“旁觀者效應(yīng)(bystandereffect)”，即TK/GCV或CD/5-FC不僅能殺死轉(zhuǎn)導(dǎo)了該基因的腫瘤細(xì)胞，而且能殺死周圍部分未轉(zhuǎn)導(dǎo)該基因的腫瘤細(xì)胞。 目前應(yīng)用HSV-TK或CD基因治療膀胱癌的研究正在進(jìn)行當(dāng)中。1997年2月美國(guó)SuttonMA等最先報(bào)道了用腺病毒載體介

5、導(dǎo)TK基因轉(zhuǎn)染并聯(lián)合GCV治療鼠膀胱癌取得成功，預(yù)示著良好的應(yīng)用前景。此后FreundCT、MoonDG、AkasakaS等先后發(fā)表了類似的研究論文。而ZhangZ等利用CD/5-FC系統(tǒng)研究膀胱癌的治療也取得了較好的效果。TrinhQT、RogersRP、RogulskiKR等的研究顯示不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)不同自殺基因有不同敏感性，在應(yīng)用自殺基因治療各種腫瘤時(shí)可能存在腫瘤細(xì)胞特異性。為充分發(fā)揮自殺基因作用，部分學(xué)者已利用CD-TK雙自殺基

6、因融合基因治療腫瘤，其中在腦膠質(zhì)瘤、肝癌、卵巢癌等腫瘤中已得到部分應(yīng)用并取得較好效果，在泌尿系統(tǒng)腫瘤特別是前列腺癌的治療中也已進(jìn)行了較多研究，部分已進(jìn)行到臨床一期實(shí)驗(yàn)。但目前尚未見(jiàn)到有關(guān)CD-TK融合基因在膀胱癌治療方面的報(bào)道。CD-TK融合基因的產(chǎn)物同時(shí)具有2種酶的活性，利用兩類自殺基因療法互補(bǔ)作用，可以大大提高其應(yīng)用價(jià)值，而不需考慮自殺基因法療的腫瘤細(xì)胞類型依賴性。據(jù)此我科建立了攜帶CD-TK融合基因的復(fù)制缺陷腺病毒載體，并設(shè)計(jì)本實(shí)

7、驗(yàn)，期望能通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確融合基因是否較單基因存在優(yōu)勢(shì)，是否存在協(xié)同效應(yīng)，并為發(fā)現(xiàn)一條治療膀胱癌的新路做一些有意義的探索。 目的：研究復(fù)制缺陷腺病毒載體介導(dǎo)的CD-TK融合基因在體外能否順利轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)染后聯(lián)合前體藥物在體外對(duì)人膀胱癌細(xì)胞是否存在殺傷作用及旁觀者效應(yīng)，及其殺傷機(jī)制是否與凋亡相關(guān)，并比較融合基因與單基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制方面有無(wú)差異，是否存在協(xié)同效應(yīng)。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究裸鼠腫瘤形成后，通過(guò)瘤體內(nèi)注射腺病毒法

8、能否使腫瘤細(xì)胞順利轉(zhuǎn)染目的基因，轉(zhuǎn)染后目的基因能否順利表達(dá)，聯(lián)合前體藥物后在體內(nèi)能否抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)，能否延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存期，并觀察治療后腫瘤病理變化。為研究融合基因療法能否有效治療膀胱腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 體外實(shí)驗(yàn)：利用含有CD-TK融合基因及綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)基因的復(fù)制缺陷腺病毒轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞株T-24細(xì)胞，以GFP表達(dá)與否作為轉(zhuǎn)染是否成功間接標(biāo)志，PCR及瓊脂

9、糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞CD及TK基因表達(dá)情況。應(yīng)用GCV和/或5-Fc作用于轉(zhuǎn)染病毒前后T-24細(xì)胞，并以四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazoliumMTT)法檢測(cè)治療后不同時(shí)間T-24細(xì)胞的存活率(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)％。按比例混合轉(zhuǎn)染后T-24細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染T-24細(xì)胞，同法給予前體藥物，MTT法檢測(cè)旁觀者效應(yīng)。并利用HE染色及Hoechst-PI雙染試劑盒檢測(cè)其細(xì)胞殺傷機(jī)理是否與凋亡相關(guān)。 體內(nèi)

10、實(shí)驗(yàn)：T-24細(xì)胞懸液注射入裸鼠頸部皮下，待成瘤后取腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞穩(wěn)定傳代后建立裸鼠皮下腫瘤動(dòng)物模型并將荷瘤鼠分為GCV+5-FC治療組(GCV+5-FC組)、病毒對(duì)照組(ControlV組)和空白對(duì)照組(ControlO組)。GCV+5-FC組及ControlV組瘤體內(nèi)注射腺病毒，4天后RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。GCV+5-Fc組給予前體藥物(GCV+5-FC)，ControlV組予生理鹽水，Con

11、trolO組給予前體藥物(GCV+5-FC)腹腔注射，觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤體積變化及生存期差異。治療結(jié)束后5天各組隨即挑選裸鼠一只取腫瘤組織進(jìn)行HE染色及TUNEL凋亡檢測(cè)，觀察其病理變化。 結(jié)果：腺病毒在體外能高效轉(zhuǎn)染T-24細(xì)胞，72小時(shí)轉(zhuǎn)染效率可接近100％。GCV和/或5-FC均能有效殺傷轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞，當(dāng)給予相同濃度前體藥物時(shí)，聯(lián)合用藥組顯示出較強(qiáng)的腫瘤殺傷作用。0.5mg/mlGCV、0.1mg/ml5-FC和G

12、CV+5-FC作用于轉(zhuǎn)染后T-24細(xì)胞72小時(shí)細(xì)胞生存率經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明72h后只加病毒的病毒對(duì)照組(ControlV組)與不加任何處理的空白對(duì)照組(ControlO組)細(xì)胞生存率無(wú)顯著差異(P=0.779)。GCV+5-FC組、5-FC組、GCV組與對(duì)照組比較均有顯著差異(P=0.000)。GCV+5-FC組與5-FC、GCV組間細(xì)胞生存率亦存在顯著差異(P=0.000)。細(xì)胞抑制率GCV+5-FC組較5-FC組及GCV組均高。而5-F

13、C組與GCV組之間無(wú)顯著差異(P=0.483)。旁觀者效應(yīng)較明顯，融合基因組明顯較強(qiáng)。生長(zhǎng)于載玻片細(xì)胞經(jīng)治療后未見(jiàn)明顯凋亡小體，而利用Hoechst-PI雙染色法檢測(cè)經(jīng)前體藥物作用后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可見(jiàn)各組細(xì)胞均有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，但聯(lián)合用藥組較單一用藥組凋亡現(xiàn)象增多。而ControlV組未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：經(jīng)治療后GCV+5-FC組腫瘤體積明顯縮小，用藥后不同時(shí)間GCV+5-FC組、與ControlV組和ControlO組腫瘤體積比

14、較均存在顯著差異(P=0.000)。且生存期明顯延長(zhǎng)。聯(lián)合用藥組可觀察到凋亡細(xì)胞，而對(duì)照組則幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞可觀察到。 結(jié)論：CD-TK融合基因聯(lián)合應(yīng)用GCV和/或5-Fc在體外能有效殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞，并存在較強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)，其殺傷機(jī)制可能與凋亡有關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明融合基因聯(lián)合前體藥物可明顯抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)，并可顯著延長(zhǎng)荷瘤鼠生存期，但無(wú)法使腫瘤完全消退。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD-TK融合基因?qū)Π螂装┲委熡幸欢ㄐЧ写嬖谝欢ú蛔?，需進(jìn)一步