ATRA增強(qiáng)HSV-TK-GCV對(duì)膀胱癌旁觀者效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,術(shù)后高復(fù)發(fā)率和對(duì)化療藥物的不敏感一直影響著膀胱癌的療效.單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因轉(zhuǎn)染治療膀胱腫瘤是目前腫瘤基因治療的重要策略之一,顯示了較好的研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用前景.實(shí)驗(yàn)已證實(shí)"旁觀者效應(yīng)"即轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞使未轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡是TK基因治療另一重要作用途徑,它與基因轉(zhuǎn)染效率被看成腫瘤自殺基因治療成功的兩大關(guān)鍵要素.在目前基因轉(zhuǎn)染效率還不盡如意的情況下,旁觀者效應(yīng)的作用越來(lái)越受重視,探討

2、如何提高旁觀者效應(yīng)是很有意義的.許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)縫隙連接細(xì)胞間通訊(GJIC)是實(shí)現(xiàn)旁觀者效應(yīng)主要機(jī)理之一.相鄰細(xì)胞膜上的連接蛋白構(gòu)成的連接子相互錨定形成中空的連接通道是細(xì)胞間通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).然而,在許多腫瘤中,組織特異性連接蛋白表達(dá)異常,引起細(xì)胞間通訊功能下降,這是自殺基因"旁觀者效應(yīng)"在許多腫瘤中不明顯的原因之一.國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí),膀胱移行上皮主要表達(dá)連接蛋白Cx26,在調(diào)節(jié)移行細(xì)胞增殖和分化起重要作用.它的異常表達(dá)及細(xì)胞間通訊功能

3、下降與膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞連接蛋白的表達(dá),改善細(xì)胞間通訊可望提高自殺基因治療的旁觀者效應(yīng).全反式維甲酸(ATRA)是人工合成維生素A衍生物,具有良好的調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊功能的作用,但是,對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用不同.目前,連接蛋白Cx26在膀胱癌中的表達(dá)情況如何,以及ATRA能否調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的GJIC功能,目前的研究極少.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?基于目前的研究現(xiàn)狀,我們?cè)谠搶?shí)驗(yàn)中:1、觀察膀胱移行細(xì)胞癌中Cx26表達(dá)情況及生物

4、學(xué)意義.2、體外觀察ATRA是否有提高HSV-TK/GCV對(duì)膀胱癌細(xì)胞的旁觀者殺傷作用,探討其作用機(jī)理是否與提高Cx26的表達(dá)及改善膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞間通訊有關(guān).為聯(lián)合應(yīng)用ATRA 和HSV-TK/GCV基因系統(tǒng)治療膀胱癌提供理論依據(jù).實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:1、通過(guò)免疫組化觀察15例正常膀胱組織標(biāo)本、35例移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本以及體外培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞株BIU-87中Cx26表達(dá)情況.Cx26在所有膀胱移行上皮細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá),主要表達(dá)在細(xì)胞膜上,而在腫瘤

5、組織中,約68.3﹪表達(dá)降低或不表達(dá),5例異常表達(dá)在胞漿或胞核上,Cx26在早期高分化腫瘤中表達(dá)降低,且隨腫瘤惡性程度增加有降低趨勢(shì).在BIU-87細(xì)胞系中幾乎不表達(dá).RT-PCR測(cè)6例正常移行上皮組織和6例腫瘤組織及BIU-87細(xì)胞的Cx26 m RNA,并行半定量分析,Cx26 m RNA水平在腫瘤組織和BIU-87細(xì)胞株中顯著降低(p<0.05).2、體外觀察全反式維甲酸對(duì)膀胱癌細(xì)胞株BIU-87生長(zhǎng)抑制作用,劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)

6、觀察ATRA不同濃度不同時(shí)相細(xì)胞間通訊功能的變化,同時(shí)行免疫組化和RT-PCR 觀察Cx26表達(dá)的改變.結(jié)果ATRA 顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡,增加連接蛋白Cx26的表達(dá),改善細(xì)胞間通訊功能,隨劑量增加而增強(qiáng),呈劑量相關(guān)性.3、觀察全反式維甲酸處理后的BIU-87細(xì)胞對(duì)HSV-TK/GCV殺傷作用的敏感性:把BIU-87-TK(+)和BIU-87-TK(-)細(xì)胞按不同比例混合培養(yǎng)(BIU-87-TK陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例分別為0.1、

7、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0),MTT法觀測(cè)ATRA對(duì)TK基因旁觀者殺傷作用的影響,結(jié)果經(jīng)ATRA處理后顯著提高TK基因的旁觀者殺傷作用(p<0.05),尤其當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞比例為0.4、0.6時(shí)最顯著.結(jié)論:在膀胱移行細(xì)胞癌中縫隙連接蛋白Cx26表達(dá)降低或異常分布,可能是導(dǎo)致細(xì)胞間連接通訊功能下降的主要原因,且與腫瘤惡性生物學(xué)有密切關(guān)系.ATRA可以顯著提高HSV-TK對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞的旁觀者殺傷作用,可能與通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)