HSV1-sr39TK-GCV對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)及“旁觀者效應(yīng)”機(jī)制探討.pdf

1、本研究通過脂質(zhì)體介導(dǎo)HSV1-TK基因和其突變體HSV1-sr39TK基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建了表達(dá)HSV1-TK和HSV1-sr39TK基因的C6細(xì)胞，進(jìn)而通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，比較評(píng)估了兩者對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制和殺傷效應(yīng)；同時(shí)采用GJIC的阻斷劑18α-甘草次酸(18α-glyeyrrhetinic acid，AGA)來觀察自殺基因系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)是否會(huì)因間隙連接的阻斷而被抑制，并對(duì)AGA干預(yù)前后的細(xì)胞進(jìn)行間隙連接蛋白43(connexin

2、43，Cx43)表達(dá)的檢測，探討AGA對(duì)間隙連接的阻斷是否通過抑制Cx43的表達(dá)而起作用。 實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分： 第一部分 HSV1-sr39TK基因修飾的鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的構(gòu)建 目的：構(gòu)建表達(dá)HSV1-TK(或其突變體HSV1-sr39TK基因的C6細(xì)胞。 方法：　　1.利用T載體連接將HSV1-TK的cDNA亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-TK，和已有的pcDNA

3、3-sr39TK表達(dá)質(zhì)粒一起擴(kuò)增并抽提純化，Xhol和EcoR1雙酶切鑒定，并送行測序。 2.通過Effectene試劑將pcDNA3-TK和pcDNA3-sr39TK轉(zhuǎn)染入C6細(xì)胞，所得轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為C6-TK和C6-sr39TK細(xì)胞。TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，兩步法RT-PCR檢測細(xì)胞中HSV1-TK或HSV1-sr39TK mRNA含量；同時(shí)用Western blotting及細(xì)胞免疫方法檢測各組HSV1

4、-TK或HSV1-sr39TK蛋白表達(dá)水平?！　〗Y(jié)果：1.成功獲得pcDNA3-TK質(zhì)粒，雙酶切得到1128bp的目的基因片段。經(jīng)測序鑒定，pcDNA3-TK酶切得到的1128bp片段序列，除一處無義突變外，和原始序列一致。而pcDNA3-sr39TK的雙酶切，也得到1128bp的片段，測序顯示和原始序列完全吻合，成功獲得分別含HSV1-TK或HSV1-sr39TK的peDNA3.1真核表達(dá)質(zhì)粒。 2.鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株經(jīng)重組

5、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR和Western blotting檢測表明C6-TK和C6-sr39TK組細(xì)胞均出現(xiàn)預(yù)期的特異性目的基因條帶和內(nèi)參照β-actin條帶，而未轉(zhuǎn)染組僅出現(xiàn)β-actin條帶。半定量分析顯示兩個(gè)轉(zhuǎn)染組間目的基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.058和P=0.095)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示C6-TK和C6-sr39TK組細(xì)胞均有陽染細(xì)胞出現(xiàn)，其中，前組陽性細(xì)胞占(13.25±1.12)％，后組陽性細(xì)

6、胞占(13.76±2.09)％，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.142，P=0.706)。對(duì)照組未見陽染細(xì)胞。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功克隆和構(gòu)建了分別表達(dá)HSV1-TK和其突變體HSV1-sr39TK基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-TK和pcDNA3-sr39TK，并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，RT-PCR、Western Blotting和細(xì)胞免疫化學(xué)均證實(shí)目的基因在細(xì)胞中得到有效表達(dá)，且兩個(gè)轉(zhuǎn)染組

7、目的基因的表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為進(jìn)一步的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分　HSV1-sr39TK/GCV系統(tǒng)治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)比較HSV1-sr39TK/GCV和HSV1-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)?！　》椒ǎ?.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：利用前期構(gòu)建成功的分別表達(dá)HSV1-TK和HSV1-sr39TK基因的鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞(C6-TK和C6-sr39TK)，通過MTT實(shí)驗(yàn)和Ho

8、echst-PI染色比較HSV1-sr39TK/GCV和HSV1-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)C6細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：20只裸鼠，兩側(cè)背部靠近后大腿根部皮下植瘤，其中左側(cè)接種未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，右側(cè)隨機(jī)分為兩組分別接種C6-TK和C6.sr39TK細(xì)胞。成瘤后腹腔注射GCV治療，10d為一療程?？ǔ邷y量用藥前后腫瘤體積大小，并利用micro-PET進(jìn)行腫瘤18F-FDG代謝顯像，比較活體腫瘤治療效果。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，殺鼠取瘤，進(jìn)行常規(guī)病

9、理檢查，并采用RT-PCR、Western blotting及免疫組化等檢測腫瘤組織中HSV1-TK或HSV1-sr39TK的表達(dá)情況。 結(jié)果：1.GCV作用24～48h后，C6-TK和C6-sr39TK細(xì)胞開始出現(xiàn)一系列形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞生長抑制甚至死亡。GCV濃度越高，作用時(shí)間越長，這種變化越明顯。而實(shí)驗(yàn)濃度的GCV未對(duì)未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞產(chǎn)生明顯的影響。72h的MTT結(jié)果顯示，GCV濃度在0～400μM時(shí)，C6-sr39TK細(xì)胞存

10、活率由(99.964±3.54)％下降到(4.75±1.79)％；C6-TK細(xì)胞存活率從(100.03±2.95)％降至(59.164±3.48)％，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率則從(100.29±1.20)％到(83.624±7.56)％。同一GCV濃度時(shí)，各組間細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.Hoechst-PI染色顯示，GCV作用72h后，未轉(zhuǎn)染組絕大部分細(xì)胞被hoechst 33342標(biāo)記，細(xì)胞核呈均勻、朦朧藍(lán)色

11、，只有極少數(shù)細(xì)胞呈PI標(biāo)記陽性。C6-TK和C6-sr39TK組PI陽性標(biāo)記的死亡細(xì)胞明顯較未轉(zhuǎn)染組增多，PI陽性率分別為(31.529±0.019)％和(60.960±0.020)％，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=35.765，P=0.000)：并在hoechst33342標(biāo)記陽性的細(xì)胞中，出現(xiàn)染色質(zhì)呈簇狀、顆粒大小不一、藍(lán)色高亮的凋亡細(xì)胞。 3.各組細(xì)胞在活體均能致瘤，GCV治療10d后，C6、C6-TK和C6-sr39TK

12、組腫瘤大小分別為(1287.24±364.84)、(928.47±165.61)和(574.08±107.72)mm3，較治療前均有一定程度的生長，但后兩組生長較前組明顯減緩，以C6-sr39TK組生長減緩最明顯。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.18F-FDG顯像提示GCV干預(yù)前c6、C6-TK和C6-sr39TK各組動(dòng)物腫瘤顯影都很清晰，重建圖象ROI法測定T／NT值各組依次分別為1.710±0.398、1.8

13、23±0.404、1.620±0.481，組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.150，P=0.861)。GCV治療10d后，各組動(dòng)物T/NT值分別為4.576±1.100、3.648±0.743和3.335±0.700，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.006，P=0.003)?！　?.常規(guī)病理檢查提示未轉(zhuǎn)染組為典型的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，生長活躍，核分裂像明顯。C6-TK和C6-sr39TK組腫瘤組織有大量壞死出血，伴有纖維組織增生。其中以C6-s

14、r39TK組更明顯。 6.RT-PCR、Western blotting及免疫組化均證實(shí)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)腫瘤組織中仍可檢測到目的基因的表達(dá)。 結(jié)論：體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSV1-sr39tk比HSV1-tk對(duì)GCV更敏感，可提高其與GCV所組成的自殺基因系統(tǒng)對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。在較低GCV濃度時(shí)即可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)，降低了由于GCV劑量過大所引起的免疫抑制等風(fēng)險(xiǎn)，為自殺基因系統(tǒng)的優(yōu)化和進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

15、 第三部分　HSV1-TK/GCV系統(tǒng)“旁觀者效應(yīng)”機(jī)制探討： 目的：探討GJIC在HSV1-TK/OCV自殺基因系統(tǒng)“旁觀者效應(yīng)"中的可能作用。 方法：采用GJIC的阻斷劑AGA干預(yù)C6-TK細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)自殺基因系統(tǒng)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響;借由RT-PCR、Western blotting及免疫組化檢測AGA干預(yù)前后的間隙連接蛋白Cx43的表達(dá)水平的變化情況。 結(jié)果：在同一GCV濃度處理下

16、，無AGA干預(yù)組的細(xì)胞存活率較干預(yù)組下降明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但AGA尚不能完全阻斷旁觀者效應(yīng)。RT-PCR．顯示AGA的干預(yù)，可明顯降低Cx43的mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=37.703，P=0.000)。Westernblotting的半定量分析顯示AGA的干預(yù)有下調(diào)Cx43蛋白表達(dá)水平的趨勢，但結(jié)果尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.102，P=0.069)。免疫細(xì)胞組化也未發(fā)現(xiàn)兩組間Cx43陽