γ射線誘導細胞的旁觀者效應與對tBHP影響的抗氧化酶譜反應性研究.pdf

1、腫瘤的放療是一把“雙刃劍”，放射線具有殺滅腫瘤細胞的作用，這是放療的主要目的，但是，腫瘤細胞在接受一定劑量照射后所產(chǎn)生的自由基會對正常組織細胞產(chǎn)生嚴重的損傷，這種對腫瘤細胞的殺傷作用以及對臨近正常組織細胞的損傷作用同時存在，表現(xiàn)為即時性殺傷與周身延遲性損傷的差異，因此，自由基的殺傷與副作用損傷就構(gòu)成了“同心圓作用”[1]，并與“細胞旁觀者效應”機制密切相關(guān)，影響整個放療的進程和效果。
　　放射誘導旁觀者效應(radiation i

2、nduced bystander effect，RIBE)是指未接受照射的細胞及旁觀者細胞受到照射細胞影響出現(xiàn)諸如細胞死亡、基因突變、染色體不穩(wěn)定等類似于直接受到照射的細胞出現(xiàn)的反應。旁觀者細胞與放射細胞可相鄰，也可不相鄰。其發(fā)生的機制被認為與分泌可溶性擴散因子、氧化新陳代謝、細胞縫隙連接胞間通訊等有關(guān)，氧化新陳代謝是目前研究的熱點問題。過氧化氫（H2O2）是放療的重要產(chǎn)物，是活性氧（ROS）的重要組成部分，不同劑量的輻射與ROS的產(chǎn)生

3、量呈線性關(guān)系。隨著自由基生物學研究的發(fā)展，近年的研究發(fā)現(xiàn)：低濃度的自由基，特別是H2O2能夠影響一系列信號轉(zhuǎn)導途徑。機體內(nèi)的自由基可以通過其濃度調(diào)節(jié)機體細胞的生死平衡，除了引起細胞凋亡、壞死的功能，其更廣泛的生理意義在于其對轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對細胞增殖、分化的促進；另外臨床觀察不斷有放療后二次腫瘤發(fā)生的報道，研究者多把關(guān)注點集中在旁觀者效應與細胞表觀遺傳化改變的關(guān)系上，而對于H2O2充當信號因子并通過旁觀者效應機制擴散在機體中引起一系列

4、生物學變化的研究還很少。我們認為H2O2在術(shù)后二次腫瘤的發(fā)生過程中起著重要的作用。
　　本課題分為實驗一和實驗二兩部分內(nèi)容?！皩嶒炓弧敝饕芯吭诟邉┝康妮椛湔T導下受照射細胞通過旁觀者效應對未接受照射細胞的損害，實驗表明輻射誘導受照射細胞產(chǎn)生中、高濃度的ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死?；诖嗽O(shè)計本課題的實驗二，初步探討了低濃度H2O2對細胞增殖的影響以及與抗氧化酶譜之間的關(guān)系。
　　本課題研究高效抗氧化劑

5、對旁觀者效應的干預作用，證明高效的抗氧化劑可以改善旁觀者效應，此外，低劑量的輻射產(chǎn)生的低濃度H2O2以及外源性低濃度H2O2處理細胞對腫瘤細胞都有促進增殖的作用，提示該機制與臨床放療后二次腫瘤的發(fā)展相關(guān)，不同濃度H2O2對抗氧化酶譜的影響也不同，主要通過影響上游Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)節(jié)抗氧化酶譜的表達水平，以上結(jié)果對深入證明氧化新陳代謝機制以及指導臨床放射治療后的防護具有重要的意義。
　　1、γ射線照射引起的“旁觀者效應”及

6、抗氧化劑的干預作用
　　分別給予U2OS細胞0、0.25、1.00、3.00、4.00Gy60Co-γ射線照射，照射后收集細胞按1×104的密度接種至96孔板，培養(yǎng)48小時，MTT法檢測細胞活性；收集細胞用流式細胞儀DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)活性氧的生成情況結(jié)果顯示：0.25Gy劑量照射細胞可以促進細胞的增殖，與其他各組相比具有顯著性差異（P<0.05），低劑量60Co-γ射線照射后細胞內(nèi)的活性氧（ROS）含量與陰性組相比升高，而

7、1.00、3.00、4.00Gy60Co-γ射線照射細胞后（ROS）含量與陰性組相比升高更為顯著（P<0.05），并有劑量-效應關(guān)系。
　　基于以上照射實驗的結(jié)果，我們用3Gy60Co-γ射線照射骨肉瘤U20S細胞，并將其與未經(jīng)照射的骨肉瘤U20S細胞混合培養(yǎng)，觀察引起未受照射腫瘤細胞的RIBE，同時設(shè)計了平行的Trolox細胞培養(yǎng)組，觀察抗氧化劑Trolox的干預作用。結(jié)果：與陰性組細胞相比，未受照射細胞與受照射細胞共同培養(yǎng)后的

8、細胞存活率下降（P<0.05），細胞的活性降低（P<0.05），細胞克隆集落形成率下降（P<0.05），細胞微核率含量明顯升高（P<0.05），培養(yǎng)基中的MDA含量明顯增高。經(jīng)過Trolox干涉后,上述各項指標都有明顯的改善。
　　以上結(jié)果表明：骨肉瘤U20S細胞經(jīng)過60Co-γ射線照射后引起細胞明顯損傷、氧化作用明顯增強，而將照射后的細胞與正常細胞混合培養(yǎng)，觀察到受照射的腫瘤細胞對未受照射細胞產(chǎn)生“旁觀者細胞效應”，及未受照射細

9、胞出現(xiàn)同樣的氧化損傷。具有抗氧化作用的維生素E衍生物Trolox對旁觀者效應細胞的氧化損傷具有顯著的緩解作用。這個結(jié)果一方面進一步證明了ROS是輻射引起旁觀者效應的主要活性介質(zhì)，同時也表明抗氧化劑能夠緩解這種旁觀者效應。微核率是反應DNA突變的重要指標，Trolox對微核率的改善作用有限提示單一的抗氧化劑存在靶點的局限性。本實驗為進一步探討旁觀者效應的機制以及利用抗氧化劑緩解臨床放療副作用提供了實驗依據(jù)。
　　2、低濃度H2O2對

10、腫瘤細胞增殖的影響以及抗氧化酶譜的反應性
　　在培養(yǎng)的骨肉瘤細胞U2OS中添加外源性H2O2進行干預對細胞增殖的影響的對比研究結(jié)果表明：
　　1）外源性H2O2對促進細胞增殖與凋亡存在劑量依賴性。通過給予不同濃度外源性tBHP的方式培養(yǎng)細胞，用MTT法計算IC50以及測定細胞凋亡，用以區(qū)分tBHP對U2OS細胞的增殖作用濃度和毒作用濃度，篩選出增殖影響濃度，隨后用tBHP處理細胞分為0（陰性實驗組）、1.00、10.00、4

11、0.00、100.00μmol·L-1組初步觀察低濃度tBHP對U2OS細胞增殖以及凋亡的影響。
　　結(jié)果：單純添加外源性tBHP，1.00、10.00μmol·L-1H2O2對骨肉瘤細胞系U2OS的增殖和生長具有一定促進作用（P<0.05），MTT法繪制細胞增殖曲線顯示這種促進作用在加入H2O24小時后最為明顯，流式細胞儀檢測的結(jié)果顯示1.00、10.00μmol·L-1H2O2不會促使細胞的凋亡；而40、100μmol·L-1

12、濃度H2O2對細胞表現(xiàn)出毒性作用，表現(xiàn)為40μmol·L-1H2O2對細胞增殖的抑制，晚期凋亡細胞比例明顯增高，凋亡相關(guān)因子Caspase-3與其他組相比表達增高（P<0.05），100μmol·L-1H2O2誘導細胞死亡，死亡細胞率顯著性增高（P<0.05）。
　　2）外源性H2O2啟動了抗氧化酶譜的應激性變化。測定各個濃度tBHP處理組細胞MDA水平的變化以及抗氧化酶的生物活性。利用RT-PCR、Western-Blot等技術(shù)

13、比較系統(tǒng)的觀察調(diào)節(jié)抗氧化酶系的關(guān)鍵因子Nrf2以及抗氧化酶CAT、SOD、GPX的mRNA與蛋白表達的變化，初步研究低濃度H2O2啟動抗氧化酶譜的應激性變化。結(jié)果：
　?、?.00、10.00μmol·L-1濃度tBHP組，抗氧化酶的生物活性與陰性組相比表達降低或變化不顯著；MDA含量低于陰性組，但是，40μmol·L-1組MDA含量與1.00、10.00μmol·L-1組相比，顯著升高（P<0.05）。結(jié)果說明，細胞內(nèi)MDA的形

14、成和抗氧化酶譜的變化，與給與的H2O2劑量具有顯著相關(guān)性，低水平的H2O2（1.00、10.00μmol·L-1以下）沒有造成細胞氧化應激，當H2O2超過一定濃度后，能夠啟動細胞內(nèi)抗氧化酶系的調(diào)節(jié)機制。低劑量H2O2刺激細胞，抗氧化酶水平不升高，所顯現(xiàn)的只是信號因子作用，當H2O2水平增加,細胞產(chǎn)生氧化應激，能夠啟動抗氧化酶譜應激性表達，表達上調(diào)發(fā)揮應激損傷的干預抑制作用。
　?、诳寡趸富蚺c蛋白水平的變化。各濃度組的抗氧化酶m

15、RNA水平表達:Cu/Zn-SOD以及GPX1表達變化明顯，不同濃度H2O2組之間表達出現(xiàn)明顯差異，蛋白水平表達趨勢與mRNA基本一致，40、100μmol·L-1與1.00、10.00μmol·L-1組相比蛋白水平表達上調(diào)（P<0.05）。
　?、劭寡趸诵纳嫌握{(diào)控因子Nrf2的變化。Nrf2被認為是抗氧化酶的調(diào)節(jié)因子，Western-blot測定顯示：1.00、10.00μmol·L-1組與陰性組相比表達略有下調(diào)，40、100

16、μmol·L-1組表達開始上調(diào)，其中以100μmol·L-1組最高。
　　以上結(jié)果說明低濃度的H2O2（1.00、10.00μmol·L-1）可以促進腫瘤細胞的增殖，發(fā)揮信號因子的作用，也能被細胞的抗氧化系統(tǒng)有效清除，隨著H2O2濃度的增高，Nrf2的表達增強，抗氧化酶Cu/Zn-SOD以及GPX1的表達也被調(diào)控性增強，說明一定濃度水平的H2O2通過啟動Nrf2上調(diào)表達而對下游基因發(fā)揮著調(diào)節(jié)的作用。
　　實驗二以建立細胞模型

17、為基礎(chǔ)，從外源性添加H2O2處理細胞并結(jié)合實驗一內(nèi)低劑量輻射可以產(chǎn)生低劑量H2O2的結(jié)果，兩方面探討了低劑量的H2O2對腫瘤細胞增殖的影響，證明低劑量H2O2可以促進細胞的增殖，外源性低濃度的H2O2可能作為信號分子參與了細胞的增殖，且可以被細胞內(nèi)的抗氧化酶清除從而避免細胞的氧化損傷，而外源性H2O2在高于一定濃度后表現(xiàn)為對細胞的氧化損傷，引起氧化應激發(fā)揮細胞毒作用，并且可能通過引起Nrf2的表達增高來調(diào)節(jié)抗氧化酶譜的表達，從而激活機體

18、的抗氧化防御體系。
　　放療過程中不可避免的會有H2O2的產(chǎn)生，產(chǎn)生內(nèi)源性的H2O2通過旁觀者效應機制在非放射線照射的組織和細胞引起生物學效應，這種效應可能是對正常組織的造成氧化損傷也可能促進細胞的增殖，發(fā)揮損傷作用為主還是促進增殖與H2O2作用細胞的濃度相關(guān)，H2O2的濃度能夠影響機體抗氧化酶的表達，其機制可能是通過反饋調(diào)節(jié)Nrf2來改變下游抗氧化酶的表達，同時啟動機體抗氧化應激機制。本課題的研究的結(jié)果為探討臨床放療后二次腫瘤的