雙歧桿菌介導HSV-tk-GCV治療大鼠膀胱癌分子機制研究.pdf

1、膀胱癌（bladder cancer）是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤，同時也是全身十大常見腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康。手術是治療膀胱癌的主要手段，同時并輔以放化療以及生物治療，但復發(fā)率高，總體生存率仍不理想。因而，在最新的分子生物學研究成果基礎上，進一步研發(fā)有效的膀胱癌治療方法，具有重大的理論和現實意義。當前，基因治療仍舊占據著腫瘤研究的前沿陣地，其中自殺基因療法是近年來腫瘤基因治療研究的主力軍，單純皰疹病毒胸苷激酶基因(herpes

2、 simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)/丙氧鳥苷(ganciclovir, GCV)作為目前研究最早最徹底并且最有效的自殺基因系統之一，在腫瘤基因治療中扮演著不可或缺的角色。就腫瘤基因治療的載體系統而言，目前主要有病毒載體和非病毒載體（脂質體等），病毒載體本身有很多局限性，如病毒滴度低、宿主范圍有限、插入宿主基因組可能引起突變及病毒本身缺乏安全性等缺點，脂質體等非病毒載體，普遍存在基因轉染效率低

3、、缺乏腫瘤特異靶向性等缺點，而雙歧桿菌作為一種具有良好腫瘤靶向定植性的厭氧細菌很好的克服以往腫瘤基因治療中缺乏腫瘤組織靶向性、安全性和轉導效率低等“瓶頸”。
　　前期實驗中，我們采用雙歧桿菌介導的HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌，發(fā)現膀胱腫瘤體積縮小、重量減輕，腫瘤細胞凋亡明顯增加。本課題擬在前期研究基礎上，對雙歧桿菌介導的HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌組織進行比較蛋白質組學研究，尋求該治療系統的作用靶標，并剖析靶標

4、的功能，探索用雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌的分子機制。本論文分為二個部分。
　　第一部分雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠胱腫瘤的蛋白學研究
　　研究目的：應用 iTRAQ蛋白質組學技術研究雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV治療大鼠膀胱癌的差異表達蛋白，從整體水平上揭示該治療系統的作用機制，并篩選關鍵靶蛋白。
　　方法:
　　1.運用N－甲基亞硝基脲（MNU）膀胱灌注法建立大鼠膀胱腫

5、瘤原位模型，誘導結束后經B超檢查和病理切片判斷是否建模成功。
　　2.然后將建模成功的60只 SD大鼠隨機分為4組：雙歧桿菌/PGEX-5X-1空質粒對照組（BI/PGEX-1）、雙歧桿菌/PGEX-tk重組質粒實驗組（BI-TK）、雙歧桿菌對照組（BI）和生理鹽水對照組（normal saline），每組15只，分別經大鼠尾靜脈注射攜帶空質粒、重組質粒和未攜帶任何基因的雙歧桿菌菌液1ml（含嬰兒雙歧桿菌4.4×109個）以及生理

6、鹽水，每周給藥1次，共4次。每只SD大鼠每天腹腔注射GCV（50mg/kg），共4周。
　　3.分別取各組中部分大鼠膀胱癌組織包埋于石蠟中用于后續(xù)免疫組化檢測，提取各組膀胱癌總蛋白，依照說明書分別標記肽段，114標記生理鹽水對照組，115標記BI-TK組，116標記BI/PGEX-1組，117標記BI組。MALDI-TOF/TOF進行質譜分析。
　　4.差異蛋白質分析：利用ProteinPilot軟件分析質譜數據，用IPI

7、rat protein database v3.49軟件搜索與質譜匹配的蛋白。采用 PANTHER classification system( http://www.pantherdb.org)對差異蛋白進行GO分析，運用IPA( http://www.ingenuity.com)對差異蛋白的信號通路進行分析。
　　5.驗證差異蛋白的表達：采用蛋白質免疫印跡方法(Western blot)和免疫組化技術檢測各組膀胱癌組織中差異蛋

8、白表達情況，從而驗證蛋白組學研究的可靠性。
　　結果:
　　1. MNU膀胱灌注法建立膀胱癌模型過程中，有7只大鼠因麻醉過量死亡，有5只不明原因死亡，最后剩余63只。經B超檢查均發(fā)現膀胱內新生物出現，隨機抽取3只大鼠取膀胱內新生物病理檢查證實為膀胱癌，余下60只大鼠隨機分為4組。
　　2.質譜分析結果:實驗共鑒定出膀胱癌差異蛋白402個,其中經過治療系統處理后有192個蛋白表達下調，210個蛋白表達下調。進一步通過生物

9、信息學發(fā)現，Peroxiredoxin-I(Prx-I)與NF-κB信號通路聯系緊密，并且經過上述治療系統處理后Prx-I表達明顯下調，加之我們前期實驗發(fā)現該治療系統能使激活型的Caspase3表達增加，從而導致腫瘤細胞凋亡明顯增加，因而Prx-I可能參與到該治療系統的機制當中。
　　3.差異蛋白的功能分析：根據生物信息功能注釋，差異蛋白主要參與代謝過程(26.9％)、細胞過程(13.6%)和細胞通訊過程(20.0%)3種生物過程

10、。根據分子功能注釋，差異蛋白主要執(zhí)行催化功能(36.8%)、結合功能(28.4%)和結構性分子功能(15.1%)3種生物功能。根據蛋白種類注釋，主要包含氧化還原酶(9.8%)、細胞骨架蛋白(8.9%)、轉移酶(7.1%)、核酸結合蛋白(6.8%)及酶調節(jié)劑(6.2%)5部分。
　　4. Western Blot檢測 Prx-I的蛋白表達：與其他三組對比，BI-TK組中 Prx-I蛋白的表達量明顯下調（P＜0.001）。Westem

11、-blot結果與iTRAQ研究結果一致。
　　5.免疫組化檢測Prx-I在膀胱癌組織的表達情況。經過該治療系統處理后的大鼠膀胱癌組織中，Prx-I的表達明顯降低，表達降低具有顯著的統計學差異(P＜0.001)。免疫組化結果與 iTRAQ和 Western Blot結果一致。
　　結論:
　　1.蛋白組學的新技術iTRAQ具有精確的定量效果，而且具有較好的重復性，能夠更好地了解雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV自殺基因治療

12、系統的相關分子機制，并且尋找到該治療過程中表達的關鍵蛋白及信號通路。
　　2. iTRAQ分析并鑒定出治療前后的大鼠膀胱癌組織中差異表達蛋白402個，其中有192個蛋白表達下調，210個蛋白表達下調。通過生物信息學分析，Prx-I與NF-κB信號通路聯系緊密，加之前期實驗結果，我們推測雙歧桿菌介導 HSV- TK/GCV自殺基因治療系統是通過下調Prx-I表達然后作用于NF-κB信號通路增加膀胱癌的凋亡從而達到治療效果。
　

13、　3. Western Blot和免疫組化實驗結果與iTRAQ分析結果一致，均證實治療后Prx-I蛋白在大鼠膀胱癌組織中表達水平明顯下調，這一方面驗證了iTRAQ技術的可靠性，另一方面為進一步研究雙歧桿菌介導HSV-TK/GCV自殺基因治療系統的作用機制提供了關鍵的候選靶點。
　　第二部分 Prx-I在膀胱癌細胞中的作用及機制研究
　　研究目的:
　　1.構建Prx-I干擾質粒shRNA轉染膀胱癌細胞株T24，觀察對膀

14、胱癌細胞生物學行為的影響。
　　2.研究Prx-I與NF-κB信號通路的關系。
　　方法:
　　1.構建3條針對Prx-I的干擾shRNA序列以及無關序列作為陰性對照，通過實時定量PCR（qPCR）和Western Blot篩選最適干擾序列。
　　2. CCK8檢測沉默Prx-I基因表達后膀胱癌細胞T24的細胞增值能力。
　　3.流式細胞儀檢測沉默 Prx-I基因表達后膀胱癌細胞 T24的凋亡與細胞周期情況

15、。
　　4.利用Western Blot檢測沉默Prx-I基因表達后膀胱癌細胞T24細胞核內phospho-NF-κB p50和p65表達，以反映NF-κB信號通路的活化情況。
　　結果:
　　1.抑制膀胱癌細胞 T24中 Prx-I表達能抑制其增值能力，與無關序列組（4.51±0.73%）和空白對照組（4.96±0.46%）凋亡率相比，干擾組（21.99±1.10%）凋亡率明顯升高（P＜0.001），并且 G0/G1

16、期所占比例，干擾組（61.13±.50%）遠高于無關序列組（49.62±0.84%）和空白對照組（48.03±1.17%），故抑制膀胱癌細胞T24中Prx-I表達能阻滯膀胱癌細胞周期于G0/G1期（P＜0.05）。
　　2.抑制 Prx-I表達后膀胱癌細胞 T24胞核內 phospho-NF-κB p50 and p65表達降低。
　　結論:
　　1.抑制 Prx-I基因表達后可見膀胱癌細胞 T24增值能力下降，并且凋