重組雙歧桿菌HSV-1TK-GCV聯(lián)合抑制肝癌的研究.pdf

1、肝癌是人類最常見的癌癥之一，肝癌的常規(guī)治療方法為手術(shù)切除，給患者帶來極大的痛苦，而且由于切除不徹底，存在轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險。一旦腫瘤發(fā)生廣泛的轉(zhuǎn)移，目前臨床常用的常規(guī)治療手段都顯得束手無策，探尋一種非手術(shù)的，針對轉(zhuǎn)移性實體瘤的治療方法，尤為迫切，肝癌的基因靶向治療將會給肝癌患者帶來福音。
　　雙歧桿菌是一種革蘭陽性專性厭氧益生菌。由于雙歧桿菌能匯集在氧分壓很低的腫瘤組織中心，所以雙歧桿菌是一種很好的腫瘤基因靶向治療載體。HSV-1

2、TK與GCV共同用藥是當(dāng)今最常見的腫瘤自殺基因治療體系的組合。因此，將雙歧桿菌重組 TK與 GCV聯(lián)合（BFTK/GCV）治療肝癌等實體瘤更有技術(shù)優(yōu)勢及臨床意義。然而，天然dT和dU與野生型TK競爭性結(jié)合，減少了GCV的磷酸化從而削弱了BFTK/GCV體系的作用效果。
　　目的：篩選與GCV競爭性結(jié)合強(qiáng)，與天然脫氧核苷（dT, dU等）結(jié)合力減弱的TK突變基因，并探索雙歧桿菌不同給藥途徑的安全性，評估重組雙歧桿菌TK聯(lián)合GCV（B

3、FTK/GCV）治療肝癌小鼠模型的效果。
　　方法：構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32-TK、pET32-TK83，表達(dá)6×His-TK、6×His-TK83融合蛋白，表達(dá)的蛋白與dT、dU、GCV作用，代謝產(chǎn)物用 HPLC法檢測。將質(zhì)粒 pBEX-TK、pBEX-TK83電轉(zhuǎn)至嬰兒雙歧桿菌并進(jìn)行PCR驗證。BFTK通過肌肉注射和尾靜脈注射兩種方式注入小鼠體內(nèi)，觀察實驗動物的活動及生活狀態(tài)，并取脾臟進(jìn)行免疫組化分析。裸鼠腋下注射HepG2細(xì)胞

4、，并進(jìn)行腫瘤體內(nèi)傳代，構(gòu)建裸鼠腋下腫瘤模型。藥物作用后，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。
　　結(jié)果：已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET32-TK、pET32-TK83，并表達(dá)6×His-TK、6×His-TK83融合蛋白。E83N會極大的減弱TK與dU的競爭性結(jié)合，而與dT和GCV的結(jié)合影響不大。質(zhì)粒pBEX-TK成功電轉(zhuǎn)至嬰兒雙歧桿菌中。雙歧桿菌通過肌肉和尾靜脈兩種方式注射入小鼠體內(nèi)均安全有效，且尾靜脈注射安全性更好。成功構(gòu)建裸鼠腋下肝