BMSCs介導HSV-TK-GCV系統(tǒng)聯(lián)合連接蛋白CX43治療惡性腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤。因為它們超強的遷移能力，瘤細胞常廣泛侵襲進入正常腦組織，并可在遠離主瘤床位點形成腫瘤衛(wèi)星灶，而這些腫瘤灶也成為膠質(zhì)瘤難以治愈、術后復發(fā)和病死率居高不下的主要原因。因此對于任何切實有效的治療策略，靶向腫瘤衛(wèi)星灶的治療都是至關重要的。 與神經(jīng)干細胞(NSCs)相比，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)因其不受倫理學方面的限制，來源方便，近幾年更多地被研究人員采納。實驗顯示，基因修飾的BMSCs通過表達白介

2、素2(IL-2)或干擾素β(IFN-β)，具有良好的膠質(zhì)瘤趨向性的同時，在體內(nèi)、外試驗中還表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。然而，在這些實驗過程中也留下了許多相關問題，如BMSCs的腫瘤遷移特征和機制，長時間體外培養(yǎng)的BMSCs的性狀穩(wěn)定性以及作為基因載體治療膠質(zhì)瘤的效率等。 近幾年的研究表明，雖然少數(shù)報告Ⅲ期臨床實驗效果并不滿意，但單純皰疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韋(HSVtk/GCV)自殺基因治療系統(tǒng)從理論上仍被認為是最有前途的膠質(zhì)瘤治

3、療手段之一，不論腫瘤發(fā)生的分子病理機制如何，HSVtk/GCV病毒介導的酶前體藥物均可產(chǎn)生有效的腫瘤選擇性細胞死亡。上述毒性分子還能從HSV-tk<'+>細胞進入HSV-tk<'->細胞，產(chǎn)生所謂的殺傷“旁效應”，而臨床試驗的效果不佳的重要瓶頸之一在于基因投遞的效率過低；因此本研究擬利用BMSCs 的趨瘤性，將其作為HSVtk基因載體，同時為恢復多數(shù)膠質(zhì)瘤細胞系缺失的細胞間隙連接通訊，將連接蛋白CX43轉(zhuǎn)染于膠質(zhì)瘤細胞，以期加強旁效應，

4、提高自殺基因治療療效。 本研究分為三部分。 在第一部分首先使用當前較為成熟的原代貼壁培養(yǎng)法獲得BMSCs，并就其表面標記抗原予以流式細胞術鑒定，結果符合BMSCs特征，證實BMscs培養(yǎng)成功；然后分別采用軟瓊脂克隆形成實驗、血清依賴實驗和流式細胞周期分析檢測BMSCs的性狀穩(wěn)定性和生物安全性，這些結果顯示長期體外培養(yǎng)的BMSCs具有相對穩(wěn)定的基因表型，未見其明顯的惡性轉(zhuǎn)化。 第二部分在體內(nèi)、外利用幾個方法不同但內(nèi)

5、容相互補充的實驗進行BMSCs的膠質(zhì)瘤趨向性研究。在體外模型中，包括中央柱細胞分離培養(yǎng)體系、Matrigel球體共培養(yǎng)體系和Transwell遷移模型，從不同角度檢測BMSCs的膠質(zhì)瘤趨向性。結果顯示，BMSCs的膠質(zhì)瘤趨向性具有普遍性，但不同的膠質(zhì)瘤細胞系具有不同的趨化能力，而且這種趨化潛能很可能來自腫瘤細胞自身外分泌的細胞因子。在體內(nèi)試驗，預先建立了大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，然后將BrdU標記的BMSCs經(jīng)腫瘤對側(cè)腦半球、頸動脈和股靜脈移

6、植接種入體內(nèi)，用免疫學實驗方法檢測BMSCs在腫瘤模型內(nèi)的分布情況。結果顯示接種的BMSCs主要分布于腫瘤與正常腦組織交界部位，伴隨或包裹周圍浸潤膠質(zhì)瘤細胞或游離小灶。為研究BMSCs膠質(zhì)瘤趨向性的可能機制，該部分檢測了CXCR-4、MMP2、MMP9 3個與遷移密切相關的蛋白在BMSCs中的表達。結果顯示不同培養(yǎng)時間的BMSCs可穩(wěn)定表達CXCR4、MMP2、MMP9，并與其傳代次數(shù)無關。 第三部分，以腺病毒為TK基因載體轉(zhuǎn)染

7、于BMSCs，同時轉(zhuǎn)染CX43進入C6細胞。體內(nèi)、外實驗結果顯示細胞間隙連接通訊可有效增強HSVtk/GCv治療旁效應。將實驗動物分為四組即C6、CX43-C6、TK-BMSC/C6和TK-BMSC/CX43-C6組。通過MRI對前六周各組實驗鼠腦膠質(zhì)瘤體積檢測和連續(xù)120天動物生存期觀察，發(fā)現(xiàn)在同一時間點CX43-C6較單純C6組腫瘤體積要小得多，且動物生存期明顯延長，而TK-BMSC/C6和TK-BMSC/CX43-C6組無論從腫瘤

8、體積還是動物生存期均較以上各組顯示出更好的腫瘤殺傷作用。隨后在腫瘤內(nèi)部與邊緣進行的細胞核增殖抗原和細胞凋亡檢測均顯示出TK-BMSC/CX43/GCV治療體系對包括腫瘤衛(wèi)星灶在內(nèi)的明顯的膠質(zhì)瘤殺傷作用。 上述實驗結果顯示具有腫瘤趨向性的BMSCs作為治療前體藥物載體靶向侵襲瘤細胞對腦膠質(zhì)瘤治療是一個有著良好應用前景的新手段。隨著臨床試驗展開，大量的體外擴增及修飾，良好的遷移活性和腫瘤趨向性，BMSCs 的上述研究在成體干細胞對惡