薯蕷皂苷介導(dǎo)縫隙連接蛋白Cx43阻抗黑色素瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用機制.pdf

1、一、目的:黑色素瘤惡性程度非常高，確診時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。已經(jīng)有研究證實，在黑色素瘤中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。另外有研究表明縫隙連接蛋白Cx43和縫隙連接通訊功能的增強抑制惡性腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極性轉(zhuǎn)化及細(xì)胞因子的分泌促進(jìn)腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。縫隙連接通訊功能提高時增加巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力，縫隙連接與免疫密切相關(guān)。
　　在實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷可以提高縫隙連接蛋白表

2、達(dá)及通訊功能。本研究采用小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞和C57BL/6小鼠作為研究對象，探討薯蕷皂苷在提高縫隙連接通訊功能的基礎(chǔ)上對小鼠黑色素瘤殺傷和轉(zhuǎn)移，以及在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞模型下薯蕷皂苷治療小鼠黑色素瘤的作用機制。
　　二、方法
　　(1)薯蕷皂昔對縫隙連接蛋白及功能和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
　　1、MTT法檢測0～8μM薯蕷皂苷對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞生長的影響，以確定用于研究后續(xù)實驗

3、的Dio濃度。RT-PCR及Western bolt檢測Dio和RA對B16細(xì)胞Cx43基因和蛋白的影響，采用相對定量方法分析Cx43 mRNA水平和蛋白水平，用免疫熒光的方法檢測Dio和RA治療B16細(xì)胞48 h后Cx43蛋白的表達(dá)。用激光共聚焦顯微鏡(Confocal)及流式細(xì)胞儀檢測Dio和RA作用B16細(xì)胞48 h后GJIC的功能。
　　2、劃痕方法和transwell實驗檢測薯蕷皂苷對B16細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。

4、r>　　3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit試劑盒檢測薯蕷皂苷對MMPs活性的影響。
　　4、Dio和RA對B16細(xì)胞治療48 h后，使用胰酶消化細(xì)胞后，收集消化下來的細(xì)胞，用RIPA加PMSF裂解細(xì)胞后提取處理過的總蛋白并且定量。采用Western bolt檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白E-cadherin，N-cadherin，snail1，vimentin，

5、β-catenin及腫瘤干細(xì)胞蛋白sox-2，oct3/4，nanog的表達(dá)情況。
　　(2)薯蕷皂苷抑制小鼠黑色素瘤轉(zhuǎn)移的機制探討
　　1、Confocal檢測過表達(dá)Cx43和突變型Cx43質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。Western bolt及免疫熒光的方法檢測過表達(dá)Cx43和突變型Cx43轉(zhuǎn)染48 h后Cx43蛋白的表達(dá)從而確定轉(zhuǎn)染是否成功。劃痕標(biāo)記熒光染料示蹤技術(shù)檢測過表達(dá)Cx43和突變型Cx43轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞24 h后熒光傳輸情

6、況。從而確定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞功能是否起作用。
　　2、劃痕方法和transwell實驗檢測縫隙連接通訊功能改變對B16細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。
　　3、AmpliteTM Universal FluorimetricMMP Activity Assay Kit試劑盒檢測縫隙連接縫隙連接通訊功能改變對MMPs活性的影響。
　　4、Western bolt檢測過表達(dá)Cx43，突變型Cx43轉(zhuǎn)染48 h后，檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

7、蛋白E-cadherin，N-cadherin，snail1，vimentin，β-catenin的表達(dá)情況。
　　5、在縫隙連接通訊功能被阻斷的B16細(xì)胞上給予薯蕷皂苷處理48 h后，檢測縫隙連接蛋白Cx43，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白E-cadherin，N-cadherin，snail1，vimentin，β-catenin的表達(dá)情況。
　　6、薯蕷皂苷作用B16細(xì)胞48 h后，Western bolt檢測維甲酸受體蛋白RXRα

8、，RARα，RARβ，RARγ的表達(dá)情況。
　　(3)薯蕷皂苷對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞RAW264.7的作用
　　1、MTT法檢測0～8μM薯蕷皂苷對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞殺傷的作用。薯蕷皂苷（1μM及2μM）對RAW264.7細(xì)胞治療48 h后，Western bolt檢測縫隙連接蛋白Cx43水平，激光共聚焦顯微鏡檢測薯蕷皂苷作用RAW264.7細(xì)胞48 h后與B16細(xì)胞共培養(yǎng)以及過表達(dá)Cx43和突變型Cx43作用

9、RAW264.7細(xì)胞48 h后與B16細(xì)胞共培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞吞噬B16細(xì)胞的能力。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測薯蕷皂苷和脂多糖(LPS)作用RAW264.7細(xì)胞48 h后，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型(F4/80)，M1型(CD68，CD86，NOSi)，M2型(CD206，CD209)變化。
　　3、ELISA檢測薯蕷皂苷作用RAW264.7細(xì)胞48 h后，分泌細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6變化。
　　4、劃痕方法和tr

10、answell實驗檢測RAW264.7細(xì)胞條件培養(yǎng)液(薯蕷皂苷(0，1μM，2μM)和LPS(1μg/mL)作用RAW264.7細(xì)胞48 h后，棄培養(yǎng)基更換新鮮無藥RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基離心取上清即為條件培養(yǎng)液）作用小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞對侵襲及遷移能力的影響。
　　5、取條件培養(yǎng)液作用小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞48 h后，提蛋白及定量。采用Westernbolt檢測縫隙連接蛋白Cx43，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白

11、E-cadherin，N-cadherin，snail1，vimentin，β-catenin及腫瘤干細(xì)胞蛋白sox-2，oct3/4，nanog的表達(dá)情況。
　　(4)建立C57BL/6小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型研究薯蕷皂苷對肺轉(zhuǎn)移的影響。建立小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞主動腫瘤轉(zhuǎn)移模型和腫瘤被動轉(zhuǎn)移模型，腫瘤主動轉(zhuǎn)移模型:將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞3×105個通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，第二天開始隨機分組，實驗分組為模型組，低劑量組和高劑量組，每

12、組C57BL/6的樣本量為10只，共30只。薯蕷皂苷開始灌胃給藥，每天給藥1次，給藥18天。腫瘤被動轉(zhuǎn)移模型:將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞4×105個接種到小鼠背部。當(dāng)長出腫瘤時，隨機分組，實驗分組為模型組，低劑量組和高劑量組，每組C57BL/6的樣本量為12只共36只。以薯蕷皂苷30 mg/kg和60 mg/kg濃度開始灌胃給藥，每天給藥1次。給藥結(jié)束后，處死小鼠，取材一部分凍存于-80℃，一部分4％多聚甲醛固定。采用免疫組化的方法檢測縫

13、隙連接蛋白Cx43，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白E-cadherin，N-cadherin的表達(dá)情況。
　　三.結(jié)果
　　(1)薯蕷皂苷對縫隙連接蛋白及功能和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
　　1、MTT結(jié)果顯示薯蕷皂苷對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞有殺傷作用，半數(shù)殺傷藥物濃度為4.21μM。RT-PCR，Western bolt，激光共聚焦顯微鏡檢測薯蕷皂苷對B16的作用結(jié)果顯示，與空白對照組相比，薯蕷皂苷組上調(diào)縫隙連接Cx43的基因及蛋白水平的

14、表達(dá)。Confocal及流式細(xì)胞儀檢測薯蕷皂苷對B16的作用48 h后結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨著濃度的增加，薯蕷皂苷提高B16細(xì)胞的縫隙連接通訊功能。
　　2、劃痕方法及transwell實驗檢測薯蕷皂苷對B16細(xì)胞的作用48 h后結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨著濃度的增加，薯蕷皂苷降低B16細(xì)胞的侵襲及遷移的能力。
　　3、AmpliteTM Universal FluorimetricMMP Activity As

15、say Kit試劑盒檢測薯蕷皂苷對B16細(xì)胞的作用48 h結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨著濃度的增加，薯蕷皂苷能顯著性降低MMPs的活性。
　　4、Western bolt檢測薯蕷皂苷作用B16細(xì)胞48 h結(jié)果顯示，與空白對照組相比，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)情況顯示，薯蕷皂苷能顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)N-cadherin，snail1，vimentin，β-catenin的蛋白表達(dá)水平。腫瘤干細(xì)胞蛋白表達(dá)情況顯

16、示，隨著濃度的增加，薯蕷皂苷能顯著性降低oct3/4，sox-2及nanog表達(dá)水平。
　　(2)薯蕷皂苷通過激活維甲酸受體通路來上調(diào)Cx43從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移
　　1、用激光共聚焦顯微鏡檢測過表達(dá)及突變型Cx43的轉(zhuǎn)染效率為70％左右。瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)及突變型Cx43質(zhì)粒48 h后，采用免疫熒光及Western bolt的方法檢測結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功能夠上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)。劃痕標(biāo)記熒光染料示蹤技術(shù)檢測過表達(dá)Cx4

17、3和突變型Cx43轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞24 h后，過表達(dá)Cx43增強B16的縫隙連接通訊功能，突變型Cx43阻斷縫隙連接通訊功能。
　　2、劃痕及transwell實驗結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，過表達(dá)Cx43抑制B16細(xì)胞的侵襲和遷移能力，突變型Cx43增強B16細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　3、MMPs活性檢測試劑盒檢測過表達(dá)Cx43和突變型Cx43對B16細(xì)胞的作用結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，過表達(dá)Cx43能顯著性降低MPs活性，

18、突變型Cx43能顯著性提高M(jìn)MPs活性。
　　4、Western bolt檢測過表達(dá)Cx43和突變型Cx43對B16細(xì)胞的作用結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)情況顯示，過表達(dá)Cx43能顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達(dá)水平，顯著下調(diào)snail1，vimentin的蛋白表達(dá)水平，同時下調(diào)N-cadherin，3-catenin表達(dá)水平，顯著性差異。與之相反，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)情況顯示，突變型Cx43能顯著下調(diào)E-

19、cadherin的蛋白表達(dá)水平，顯著上調(diào)snail1，vimentin，N-cadherin，β-catenin的蛋白表達(dá)水平。
　　5、Western bolt檢測突變型Cx43的B16細(xì)胞薯蕷皂苷作用48 h結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，薯蕷皂苷能顯著上調(diào)正?？p隙連接蛋白Cx43蛋白的表達(dá)。與突變型Cx43組相比，薯蕷皂苷藥物作用后，隨濃度的增加，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)情況顯示，E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，snail1，

20、vimentin，N-cadherin，β-catenin的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　6、Western bolt檢測薯蕷皂苷作用B16細(xì)胞48 h后結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，維甲酸受體蛋白RXRα表達(dá)顯著下降，RARα，RARβ，RARγ表達(dá)顯著升高?？紤]薯蕷皂苷上調(diào)Cx43可能是通過維甲酸受體通路起作用。
　　(3)薯蕷皂苷對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用
　　1、MTT檢測薯蕷皂苷對RAW264.7細(xì)胞的生長作用，結(jié)

21、果顯示，與空白組相比，薯蕷皂苷對RAW264.7細(xì)胞的殺傷作用不明顯。Western bolt檢測薯蕷皂苷作用于RAW264.7細(xì)胞48 h上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡檢測薯蕷皂苷處理RAW264.7細(xì)胞與B16細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，隨著濃度增加，薯蕷皂苷增加RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。過表達(dá)Cx43與突變型Cx43分別與B16細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，過表達(dá)Cx43增加RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，突變型Cx43降低RAW

22、264.7細(xì)胞的吞噬能力，以上結(jié)果表明薯蕷皂苷通過上調(diào)Cx43提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測薯蕷皂苷作用于RAW264.7細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著濃度的增加，M1型標(biāo)記物NOSi，CD86，CD68表達(dá)增加，M2型標(biāo)記物CD206，CD209表達(dá)下降。薯蕷皂苷使RAW264.7細(xì)胞由M2型向M1型轉(zhuǎn)化。
　　3、ELISA檢測薯蕷皂苷作用于RAW264.7細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示

23、，薯蕷皂苷上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6。
　　4、劃痕和transwell實驗檢測RAW264.7細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用于B16細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，薯蕷皂苷組RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液降低B16細(xì)胞的侵襲及遷移能力。
　　5、Western bolt檢測RAW264.7細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用于B16細(xì)胞48 h后結(jié)果顯示，與空白對照組相比，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)情況顯示，隨著濃度的增加，薯蕷皂苷

24、組RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液能顯著上調(diào)Cx43的蛋白表達(dá)，顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)N-cadherin，snail1，vimentin的蛋白表達(dá)水平，對β-catenin蛋白表達(dá)作用不明顯。腫瘤干細(xì)胞蛋白表達(dá)情況顯示，隨著濃度的增加，薯蕷皂苷組RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液能顯著性降低sox-2，nanog，oct3/4蛋白表達(dá)水平。
　　(4)在C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移模型中薯蕷皂苷抑制B16細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移

25、>　　實驗過程中，各組C57BL/6小鼠的體重?zé)o顯著差異。腫瘤主動轉(zhuǎn)移模型及被動轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，與模型組相比隨著濃度的增加，薯蕷皂苷顯著抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組相比，薯蕷皂苷顯著上調(diào)Cx43，E-cadherin蛋白的表達(dá);顯著降低N-cadherin蛋白的表達(dá)。
　　四、結(jié)論
　　1、體外實驗中，通過上調(diào)Cx43可以阻抗黑色素瘤B16細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。薯蕷皂苷上調(diào)Cx43的表達(dá)及縫隙

26、連接通訊功能且薯蕷皂苷抑制B16細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，薯蕷皂苷通過激活維甲酸受體通路上調(diào)Cx43來抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　2、在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞占腫瘤微環(huán)境的30-50％，薯蕷皂苷通過上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)提高腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。薯蕷皂苷促使RAW264.7細(xì)胞由M2向M1轉(zhuǎn)化且促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌。薯蕷皂苷作用RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液上調(diào)Cx43表達(dá)，抑制上