心肌連接蛋白Cx43在心肌梗死患者中的表達.pdf

1、背景與目的
　　 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）一直是臨床上倍受關(guān)注的重癥疾患之一，其進展迅速，后果嚴重，其發(fā)病率正逐年上升，病死率雖然較前降低，但仍然較高，給人民的身體健康帶來了巨大的危害，也增加了社會負擔。心肌梗死患者極易發(fā)生室性心律失常或惡性心律失?；蜮溃壳捌毡檎J為其發(fā)生機制除與心肌細胞興奮性異常有關(guān)外，電耦聯(lián)障礙及傳導異常也是主要原因。心臟縫隙連接（gap juncti

2、on，GJ）通道是心肌細胞之間實現(xiàn)電偶聯(lián)及化學信息交換的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而連接蛋白43（conHexin43，Cx43）是構(gòu)成心肌縫隙連接通道特別是心室肌縫隙連接通道的主要連接蛋白（connexin，Cx），在數(shù)量、分布等方面若發(fā)生改變（Cx43重構(gòu)）時必然會引起心肌細胞間電耦聯(lián)障礙及傳導異常。因此，心肌梗死后連接蛋白43重構(gòu)是室性心律失常及惡性心律失常發(fā)生的分子解剖學基礎(chǔ)。如能在心肌梗死早期采取積極的手段來干預連接蛋白43重構(gòu)，可能對防

3、治心律失常甚至猝死的發(fā)生起到更為積極的作用.
　　 連接蛋白43是心室肌細胞間縫隙連接的主要連接蛋白，在電子顯微鏡下，連接蛋白43主要在閏盤呈簇狀分布于細胞的端對端連接處，每6個相鄰細胞間的連接蛋白43構(gòu)成跨膜連接小體（connexon），數(shù)十個小體排列在細胞膜構(gòu)成縫隙連接（gapjunction，GJ）。該區(qū)富含特殊的連接通道，故將這些通道稱為縫隙連接通道（gap junction，GJ）。它具有親水性、低選擇性和低電阻等特點

4、，是心肌細胞之間保持正常通訊及化學信息交換的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要作用是形成細胞間快速的電沖動傳導.保證心臟整體電活動同步性與協(xié)調(diào)性。
　　 由相鄰細胞膜之連接蛋白（connexin，Cx）六聚體鉚接成的細胞間低電阻通道即為心肌細胞縫隙連接（gapjunction，GJ），是細胞間電導與傳導速度的主要決定因素。雖然離子通道的功能改變是心律失常發(fā)生的一個重要因素，但不正常的細胞耦聯(lián)有時起主要作用，如心肌梗死，肥厚梗阻性心肌病，心臟淀粉

5、樣變性等，由激動傳導異常引起的折返性心律失常。因此，研究心肌梗死時縫隙連接分布的改變對于闡明心律失常的發(fā)生機制有重要意義。在哺乳動物心肌，雖然可有多種連接蛋白表達，但主要是連接蛋白43。因此研究連接蛋白43的數(shù)量和分布基本上可反映縫隙連接的數(shù)量和分布。
　　 本研究旨在通過免疫組織化學法染色觀察，比較心肌梗死時縫隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）的分布特征，探討連接蛋白43在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心肌梗死的變化規(guī)

6、律及其診斷意義。
　　 方法：
　　 實驗從青島市立醫(yī)院2007年至2009年間尸體解剖工作中挑選保存的心臟標本30例，標本診斷均符合世界衛(wèi)生組織關(guān)于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病猝死的標準，冠狀動脈狹窄以管腔面積的縮小分為4級進行分析。Ⅰ級病變：管腔面積縮小1％～25％；Ⅱ級病變：管腔面積縮小26％～50％：Ⅲ級病變：管腔面積縮小51％～75％；Ⅳ級病變：管腔面積縮小76％～100％。將其中的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心肌梗死

7、猝死者15例設(shè)為實驗組，男性11例，女性4例，另外根據(jù)取材部位不同，將梗死區(qū)定為B組，梗死區(qū)邊緣設(shè)定為C組，非梗死區(qū)設(shè)定D組。另外選擇15例與實驗組年齡相近的暴力死亡與非冠狀動脈粥樣硬化性心臟病猝死病例定為對照組A組男性9例，女性6例。
　　 在實驗組冠狀動脈粥樣硬化性心臟病伴心肌梗死中，取每例左心室部位上的心肌梗死區(qū)（infarctuszone）、心肌非梗死區(qū)（noninfarctuszone）以及梗死區(qū)邊緣（borderzo

8、nne）各一塊。由于連接蛋白43均勻分布在心室肌各層，因此，在對照組各病例中左心室取一塊心室肌做為分析對照。用生理鹽水清洗去心肌附著物，放入10％的甲醛溶液中固定24小時，取出后進行流水沖洗10分鐘后進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟切片，片厚4μm，每個標本各取15片，用免疫組化SABC法進行免疫組織化學染色：切片常規(guī)脫蠟至水，然后用3％H2O2滅活內(nèi)源性酶，然后熱修復抗原，然后用復合酶消化暴露抗原，然后用正常兔血清封閉然后滴加Cx

9、43抗體然后生物素化山羊血清然后SABC，再用DAB顯色，在上述步驟間均用PBS洗滌5分鐘，然后脫水，透明，中性樹膠封片，光鏡觀察；染色過程中另用PBS緩沖液替代一抗作為空白對照。每張切片隨機編號，在盲法下進行評價。采用免疫組織化學染色陽性細胞記數(shù)，在高倍視野（×400）下隨機選擇5個視野，依次計數(shù)每個視野內(nèi)連接蛋白43陽性的縫隙連接數(shù)，并計算連接蛋白43陽性的縫隙連接總數(shù)。然后再測量各視野中的陽性產(chǎn)物面積，根據(jù)細胞內(nèi)陽性蛋白表達面積的

10、半定量實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用北航MAIS病理圖像分析系統(tǒng)分析縫隙連接中連接蛋白43陽性表達，統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.大體觀察實驗組冠狀動脈粥樣硬化性心臟病猝死伴心肌梗死心臟標本中，男性11例，女性4例（平均年齡45歲）。發(fā)現(xiàn)實驗組心臟普遍增大，左心室壁增厚。這其中發(fā)生了心臟破裂的有2例，前壁破裂1例。破裂部位在室間隔1例，其中1例破裂區(qū)伴有心肌出血。8例心臟肥大擴張，6例心臟有左室前壁

11、、側(cè)壁、室間隔、左室后壁心肌梗死，并且有陳舊性病灶并存；而其余9例有局灶性心肌梗死病灶，并合并心肌出血。每個病例都伴有1支或1支以上冠狀動脈狹窄≥75％，合并冠狀動脈內(nèi)出血、破裂等。在年齡相近的對照組中，男性9例，女性6例（平均年齡43歲），心臟大體檢查均沒有發(fā)現(xiàn)心臟增大，亦無冠狀動脈狹窄與缺血等發(fā)現(xiàn)。從死亡至尸檢時間，實驗組6～50 h（平均24 h），對照組8～32 h（平均22 h）。
　　 2.心臟HE染色鏡下可發(fā)現(xiàn)實驗

12、組均有不同程度的冠狀動脈粥樣硬化，其中部分病例有膽固醇結(jié)晶體及鈣鹽沉積；發(fā)現(xiàn)心肌間質(zhì)擴張、瘀血的有8例；發(fā)現(xiàn)乳頭肌心肌纖維斷裂的有6例；不同程度的心肌變性、壞死在各例中都有發(fā)現(xiàn)，內(nèi)檢見心肌陳舊性疤痕組織，其中可發(fā)現(xiàn)有不同程度的心肌纖維斷裂，心肌閏盤結(jié)構(gòu)消失。而在對照組中，心肌結(jié)構(gòu)基本是正常的，僅有少量病例在心肌外膜發(fā)現(xiàn)有局部少量心肌出血，心肌細胞之間的閏盤結(jié)構(gòu)清晰可見。
　　 3.Cx43免疫組化染色正常心肌（對照組）可見排列有

13、高度的規(guī)律性的磷酸化連接蛋白43集中于心肌閏盤處；在心肌纖維長軸垂直的細胞端端相連的部位可見縫隙連接呈簇狀分布，而僅有少數(shù)縫隙連接位于與心肌纖維長軸平行的細胞側(cè)側(cè)相連的部位；在心肌各層中連接蛋白43均有密集分布，沒有發(fā)現(xiàn)連接蛋白43密度顯著增高或降低的區(qū)域。
　　 在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心肌梗死猝死病例（實驗組）中，不同心肌部位的縫隙連接蛋白Cx43陽性表達差異性比較大。與正常心肌相比。連接蛋白43的分布在梗死病灶及其鄰近區(qū)

14、域出現(xiàn)顯著紊亂，連接蛋白43在一部分梗死中心區(qū)域已經(jīng)完全消失，而一部分梗死中心區(qū)連接蛋白43有一部分連接蛋白發(fā)生了重新分布，散在分布于細胞質(zhì)中；在邊緣帶與壞死區(qū)鄰接處絕大部分連接蛋白43已消失，只有極少數(shù)連接蛋白43分布于心肌細胞側(cè).側(cè)相連處?？梢娫S多島狀、半島狀的尚存活心肌在邊緣帶附近，一些連接蛋白43散在分布于心肌細胞側(cè)-側(cè)相連處。此外，在非梗死處心肌在形態(tài)學上還算正常的（可能是存活的），但細胞之間的閏盤連接蛋白43重度損壞崩解，尤