慢病毒介導(dǎo)的HSV-tk-GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的殺傷作用研究.pdf

1、第一部分 慢病毒載體構(gòu)建、病毒包裝和純化 目的:構(gòu)建廣譜(CMV)和特異性啟動(dòng)子(LEP503)調(diào)控的Lenti-HSV-tk載體，建立高效的慢病毒轉(zhuǎn)基因平臺(tái)。 方法:利用分子克隆技術(shù)，將HSV-tk基因插入慢病毒載體Lenti-ires-EGFP中，構(gòu)建廣譜啟動(dòng)子CMV調(diào)控的HSV-tk基因表達(dá)的慢病毒載體(Lenti．CMV-HSVtk-EGFPl。應(yīng)用PCR方法從人晶狀體上皮細(xì)胞系(HLEC)基因組中克隆L

2、EP503啟動(dòng)子序列，構(gòu)建單純LEP503啟動(dòng)子調(diào)控HSV-tk基因表達(dá)的慢病毒載體(Lenti-Lep503-HSVtk-EGFP)。利用慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒并收集上清液中病毒顆粒，感染晶體上皮細(xì)胞及其他細(xì)胞。 結(jié)果:構(gòu)建的慢病毒載體Lenti-CMV-HSVtk-EGFP能高效轉(zhuǎn)染各類細(xì)胞并持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。在利用該慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染晶體上皮細(xì)胞時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOl：100)時(shí)，轉(zhuǎn)染效率接近1

3、00％，且傳代培養(yǎng)6個(gè)月后仍能維持高轉(zhuǎn)染效率。因此雙基因共表達(dá)的慢病毒載體能高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HLEC，為下一步的實(shí)驗(yàn)提供可靠的技術(shù)平臺(tái)今。 第二部分 Lenti-CMV-HSVtk／GCV對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀察CMV調(diào)控的慢病毒介導(dǎo)HSV-tk／GCV系統(tǒng)對(duì)HLEC的殺傷效應(yīng)，并研究其殺傷作用機(jī)制。 方法:HSV-tk和報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)共表達(dá)的慢病毒感染細(xì)胞作為試驗(yàn)組

4、，僅表達(dá)EGEP的慢病毒感染細(xì)胞和正常細(xì)胞作為對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒的轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡觀察及基因組PCR和RT-PCR檢測(cè)基因在HLEC內(nèi)表達(dá)，DNAl甜der和電鏡觀察HSV-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)HLEC的殺傷作用，CCK一8試劑盒檢測(cè)HSV-tk/GCV系統(tǒng)的濃度與時(shí)間依賴性及其旁觀者效應(yīng)。 結(jié)果:慢病毒系統(tǒng)能使共表達(dá)的HSV—tk和EGFP高效整合入HLEC的基因組并高效表達(dá)。當(dāng)GCV濃度為10～25ug/ml時(shí)，能

5、明顯誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染HSV—tk的HLEC凋亡或壞死，且隨濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)作用增強(qiáng)，同時(shí)存在明顯的旁觀者效應(yīng)。在同樣的GCV濃度范圍內(nèi)對(duì)照組EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常細(xì)胞則無(wú)顯著毒性，但當(dāng)GCV濃度>25ug/ml時(shí)，由于GCV的自身毒性對(duì)照組細(xì)胞的增殖也被顯著抑制。 第三部分 Lemti-LeP503-HSⅥk，GCV在晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)的特異性及靶向殺傷作用 目的:研究Lenti-LEP503．HSVtk．EGF

6、P／GCV對(duì)HLEC的靶向性殺傷作用 方法:分別以HLEC，Hela細(xì)胞為研究組，轉(zhuǎn)入特異性表達(dá)載體Lemi-LEP03-HSvtk-EGFP，三天后熒光顯微鏡觀察兩組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，并收集細(xì)胞作RT-PCR，判斷其組織特異性表達(dá)情況。以HLEC為研究組，分別轉(zhuǎn)入非特異性表達(dá)載體Lenti-CMV-HSVtk-EGFP和特異性表達(dá)載體Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP，通過(guò)熒光顯微鏡觀察、FACS及RT-PCR比較CM

7、V與LEP503啟動(dòng)子間HSV-tk表達(dá)的差異。CCK．8檢測(cè)兩系統(tǒng)的殺傷作用差異。 結(jié)果:Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP能在HLEC中特異性表達(dá)，但HSV-tk在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)效率明顯低于CMV啟動(dòng)子。熒光顯微鏡觀察20ug／mlGCV作用下的Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，作用48小時(shí)后EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化。CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制情況發(fā)現(xiàn)，GCV作用24

8、h后Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞較正常HLEC組和Lenti-LEP503-HSVtk轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞活性有明顯抑制，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效果逐漸增強(qiáng)。 第四部分 全反式視黃酸(ATRA)對(duì)ⅡSV—tk／GCV系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)的增強(qiáng)作用研究 目的:研究全反式視黃酸(ATRA)對(duì)HSV-tk／GCV系統(tǒng)在HLEC中旁觀者效應(yīng)的增強(qiáng)作用，并通過(guò)觀察ATRA作用前后細(xì)胞中Connexin43的表達(dá)

9、，探討ATRA增強(qiáng)HSV-tk／GCV系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)的機(jī)理。 方法:通過(guò)CCK-8檢測(cè)ATRA對(duì)晶體上皮細(xì)胞的毒性，得到無(wú)毒劑量ATRA。Westernblot檢測(cè)Connexin43的表達(dá)，CCK-8和DNAladder檢測(cè)ATRA對(duì)自殺基因旁觀者效應(yīng)的增強(qiáng)作用。 結(jié)果:Westernblot結(jié)果顯示晶體上皮細(xì)胞自身表達(dá)的Connexin43較弱，隨著作用時(shí)間(O、12、24、36、48小時(shí))的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)。DNA

10、ladder和CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATRA能增強(qiáng)廣譜啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子的旁觀者效應(yīng)。 結(jié)論: 1.構(gòu)建廣譜啟動(dòng)子和晶體上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的慢病毒HSV-tk和EGFP共表達(dá)載體，使HSV-tk基因表達(dá)及對(duì)細(xì)胞的殺傷作用方便的通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)。 2.慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)CMV-HSV-tk整合入HLEC的基因組并高效表達(dá)。當(dāng)GCV濃度為10-25μg/ml時(shí)，GCV對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞有明顯的致凋亡或壞死作用，且隨濃