多肽介導(dǎo)的納米遞釋系統(tǒng)靶向治療腦膠質(zhì)瘤研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤占腦部腫瘤發(fā)病數(shù)的40％左右，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤。臨床上傳統(tǒng)治療方法為手術(shù)切除，但因為腦腫瘤部位接近患者的中樞神經(jīng)，手術(shù)難以完全清除而易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)?；熓悄X膠質(zhì)瘤諸多治療環(huán)節(jié)中至關(guān)重要的一環(huán)，其成敗直接影響病人的生活質(zhì)量和預(yù)后。然而，由于血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)和血瘤屏障(blood-brain tumor barrier, BTB)的存在限制了藥物向膠質(zhì)瘤內(nèi)部的遞送，同時藥物較弱的滲透

2、能力和入胞效率使腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度過低，導(dǎo)致目前臨床化療效果極其不理想。因此有效地增加膠質(zhì)瘤組織中抗腫瘤藥物的濃度，并提高藥物的細胞內(nèi)化是提高化療藥物療效的關(guān)鍵。
　　針對于此，本課題設(shè)計和構(gòu)建了兩種新型的納米遞釋系統(tǒng):(1)以可活化（觸發(fā)式）低分子量魚精蛋白（activatable low-molecular-weight protamine，ALMWP）為靶向配體的腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)，以期解決吸附介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤靶向遞

3、藥系統(tǒng)缺乏細胞選擇性問題;(2)以MT1-AF7p肽修飾聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒聯(lián)合腫瘤穿透肽iRGD共同注射構(gòu)建的共給藥納米遞藥系統(tǒng)，以期解決受體介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤靶向遞藥研究中靶向效率低的問題。通過兩種不同的策略來探索具有高度膠質(zhì)瘤血管穿透和腫瘤滲透能力的納米遞藥系統(tǒng)，用于提高膠質(zhì)瘤的治療效果。
　　本文第一部分構(gòu)建了以可活化（觸發(fā)式）低分子量魚精蛋白(activatablelow-molecular-weight

4、protamine，ALMWP)為靶向配體的腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)。低分子量魚精蛋白(low molecular weight protamine，LMWP)是一種具有廣闊應(yīng)用前景的細胞穿膜肽，具有與人免疫缺陷病毒(HIV)的轉(zhuǎn)錄活化因子Tat蛋白相似的穿膜性質(zhì)，能介導(dǎo)遞釋系統(tǒng)高效入胞，但是其靶向性差，幾乎對所用細胞都有作用。在本研究中我們結(jié)合了在膠質(zhì)瘤的血管內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞均高表達的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metall

5、oproteinase，MMP）MMP-2和MMP-9，以及穿膜肽LMWP能介導(dǎo)納米遞釋系統(tǒng)高效入胞的特點，設(shè)計了一種新型的可活化穿膜肽ALMWP。ALMWP包括三部分:一為穿膜肽低分子量魚精蛋白（low molecular weight protamine，LMWP）部分，其帶正電荷并具有強大的穿膜能力和運載潛能:二為負電性的陰離子肽段部分，能中和穿膜肽的正電荷;三為連接部分，選擇能被MMP-2/9高效切割的基質(zhì)肽PLGLAG作為連接

6、肽段。在本研究中，我們采用將ALMWP修飾到包載紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的聚乙二醇聚-己內(nèi)酯(PEG-PCL)納米粒表面(ALMWP-NP-PTX)用于腦膠質(zhì)瘤的靶向治療研究，該系統(tǒng)具有以下特性:(1) ALMWP在未被切割之前整體電荷保持中性，將其修飾到納米遞釋系統(tǒng)上不會改變其電位，體內(nèi)給予后仍然保持納米粒的長循環(huán)性質(zhì);(2)納米粒到達腫瘤部位后，由于腫瘤部位高度表達金屬基質(zhì)蛋白酶，能高效切割PLGLAG序列而使陰離子部

7、分解離，陽離子部分暴露而發(fā)揮強大穿膜作用，從而使納米粒大量被腫瘤細胞所攝取。
　　這部分的研究中，首先通過開環(huán)聚合法合成納米材料聚乙二醇聚己內(nèi)酯(MPEG-PCL)和馬來酰亞胺聚乙二醇聚己內(nèi)酯(Maleimide-PEG-PCL)并采用乳化溶媒蒸發(fā)法制備包載PTX的納米粒(NP-PTX)，利用馬來酰亞胺基特異性反應(yīng)構(gòu)建ALMWP修飾的載紫杉醇納米粒(ALMWP-NP-PTX)。制得的ALMWP-NP-PTX大小均勻，形態(tài)圓整，平均

8、粒徑為121 nm，Zeta電位為-21.8mV。細胞攝取結(jié)果顯示，與普通納米粒相比，ALMWP修飾的靶向納米粒顯著增加了C6膠質(zhì)瘤細胞的攝取，并且其攝取過程是MMP-2/9依賴的，可被MMP抑制劑metastat抑制。C6腫瘤球滲透實驗結(jié)果也表明ALMWP-NP可顯著增強納米粒對實體腫瘤的滲透能力。攝取抑制實驗結(jié)果表明ALMWP-NP的內(nèi)吞需要能量，通過巨胞飲和脂筏介導(dǎo)的兩種內(nèi)吞途徑入胞，并且內(nèi)吞過程有高爾基體和酸性溶酶體參與。藥動學(xué)

9、結(jié)果顯示ALMWP-NP-PTX組的AUC是LMWP-NP-PTX組的4.7倍(p＜0.001)，清除率(CL)相對于LMWP-NP-PTX組顯著降低(p＜0.001)。與LMWP-NP-PTX相比，ALMWP-NP-PTX的體內(nèi)藥動學(xué)行為得到明顯改善;LMWP-NP-PTX由于其較強的正電荷而使其的非特異性攝取增加，血漿中的滯留時間顯著變短，而ALMWP-NP-PTX與NP-PTX的體內(nèi)長循環(huán)效果相當，各藥動學(xué)參數(shù)無顯著性差別。荷C6

10、異位皮下瘤裸鼠的組織分布結(jié)果表明，ALMWP-NP顯著的增加了PTX在腫瘤部位的蓄積，其在各時間點腫瘤組織中PTX濃度分別為Taxol組濃度的2.31，3.73，2.90，2.20，2.77，2.86倍;NP組的2.02，2.49，2.40，1.79，2.49，2.74倍;LMWP-NP組的1.65，1.90，2.18，2.28，3.07，3.21倍。ALMWP-NP組在顯著增加腫瘤部位藥物濃度的同時，在非靶器官的蓄積和NP組無顯著性差

11、異。荷原位C6腦膠質(zhì)瘤的裸鼠活體成像結(jié)果證明，在納米粒表面修飾ALMWP可明顯增加其在體內(nèi)膠質(zhì)瘤中的蓄積。荷原位瘤腦組織的冰凍切片實驗結(jié)果顯示在納米粒表面修飾ALMWP可明顯增加其在體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤部位的蓄積和滲透。細胞毒結(jié)果顯示，ALMWP修飾的納米粒顯著增大了PTX對膠質(zhì)瘤細胞的毒性作用。荷C6原位瘤小鼠的藥效學(xué)結(jié)果顯示，ALMWP-NP-PTX組的平均生存時間為48天，顯著高于生理鹽水組（20.5天）(p＜0.01，log-rank

12、analysis)，Taxol組（24天）(p＜0.01)，NP-PTX組（30天）(p＜0.01)和LMWP-NP-PTX組（34.5天）(p＜0.05)。
　　本文第二部分以MT1-AF7p肽修飾聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒聯(lián)合腫瘤穿透肽iRGD構(gòu)建共給藥納米遞釋系統(tǒng)。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane type1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）在膠質(zhì)瘤的血管生成和侵襲等過

13、程中發(fā)揮重要作用。MT1-MMP在腦膠質(zhì)瘤細胞和新生血管內(nèi)皮細胞上均高表達，其表達量隨腦膠質(zhì)瘤惡性程度增加而增加，因此可作為臨床預(yù)后判斷的依據(jù)和臨床治療的靶點。MT1-AF7p肽是通過噬菌體展示技術(shù)篩選出來的含13個氨基酸的短肽，對MT1-MMP具有特異的親和性。本研究將MT1-AF7p肽修飾在包載PTX的聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒表面(MT1-NP-PTX)，通過膠質(zhì)瘤細胞和腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞上均高表達的MT1-MMP

14、介導(dǎo)增加納米粒的膠質(zhì)瘤主動靶向能力。iRGD肽（CRGDK/RGPDC）通過與腫瘤血管內(nèi)皮特殊表達的αv整合素相結(jié)合從而定位于腫瘤，隨后在腫瘤中分裂成CRGDK/R，進一步結(jié)合神經(jīng)纖毛蛋白Neuropilin-1(NRP-1)。CRGDK/R與NRP-1的結(jié)合調(diào)控著一種激活的運輸系統(tǒng)，讓同時注射的藥物從血管中滲出，從而調(diào)節(jié)藥物的一種特殊的腫瘤組織滲透性。為了提高遞藥系統(tǒng)的膠質(zhì)瘤靶向效率，本研究將MT1-AF7p肽修飾的PEG-PLA納米

15、粒聯(lián)合iRGD肽共同注射構(gòu)建共給藥系統(tǒng)，以克服BTB的阻礙作用，進一步增加納米粒透過膠質(zhì)瘤血管的能力和在腫瘤部位的蓄積。
　　采用乳化溶媒蒸發(fā)法制備包載PTX的PEG-PLA納米粒(NP-PTX)，并通過納米粒表面的馬來酰亞胺基團將MT1-AF7p共價結(jié)合到納米粒表面。制備的MT1-NP-PTX粒徑在131 nm左右，Zeta電位-31.43 mV，納米粒表面MT1-AF7p肽的連接數(shù)目為317。C6細胞攝取的定性結(jié)果顯示，其對M

16、T1-NP的攝取顯著高于NP。細胞攝取的定量結(jié)果顯示，C6細胞對MT1-NP的攝取呈現(xiàn)時間、濃度和溫度依賴性，說明其對MT1-NP的攝取是一個主動轉(zhuǎn)運過程。攝取抑制實驗結(jié)果表明MT1-NP的內(nèi)吞需要能量，主要通過巨胞飲和脂筏介導(dǎo)的兩種內(nèi)吞途徑入胞，并且內(nèi)吞過程有高爾基體參與。通過C6細胞毒和細胞凋亡等實驗表明MT1-AF7p肽修飾的納米粒顯著增大了PTX對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用。體外C6細胞三維腫瘤球模型評價結(jié)果表明MT1-AF7p肽的修

17、飾顯著增強了納米粒對實體腫瘤的滲透能力和抑制能力。通過荷C6原位瘤小鼠的體內(nèi)實驗評價共給藥系統(tǒng)的膠質(zhì)瘤體內(nèi)靶向性。小動物活體成像和腦組織的冰凍切片結(jié)果顯示，MT1-AF7p肽的修飾和iRGD肽的共給藥顯著提高了納米粒穿過腫瘤血管的能力和在膠質(zhì)瘤部位的蓄積。原位膠質(zhì)瘤裸鼠的生存時間考察結(jié)果顯示，共給藥組(MT1-NP-PTX+ iRGD)的平均生存時間為60天，顯著高于Saline組（21天）(p＜0.001,log-rank analy