腦靶向樹枝狀高分子納米基因遞釋系統的研究.pdf

1、基因治療是許多腦部疾病極具潛力的治療手段。由于治療基因本身、病毒載體或未經修飾的非病毒載體無法自主跨越血腦屏障(BBB)到達腦部,目前腦部基因導入的主要方法是腦實質直接定位注射,該方法傷害大,難以實施多次給藥,且基因產物蛋白很難轉運到腦的廣泛范圍。特異性修飾的非病毒載體有可能經血管途徑給藥,以非侵襲性方式實現外來基因藥物在腦部的廣泛表達,但其基因轉染和表達的效率普遍較低。探索具有腦靶向性且高效表達的非病毒基因載體,實現經血管給藥達到腦部

2、外源性基因的廣泛表達,成為目前腦部疾病基因治療領域的重點和難點之一。
　　 本課題通過藥劑學、高分子學和生物學手段的交叉應用,對載體高分子、腦靶向頭基進行比較和篩選后最終構建了一種新型高效的腦靶向非病毒納米基因遞釋系統。該系統以陽離子高分子聚酰胺-胺(PAMAM)為基礎載體高分子,通過親水性高分子聚乙二醇(PEG)連接新型腦靶向頭基乳鐵蛋白(Lf),與基因復合形成PAMAM-PEG-Lf/DNA納米粒。該納米粒具有以下兩大特性:

3、(1)利用腦部表達Lf相關受體的特征,采用Lf作為腦靶向頭基修飾載體高分子,增加納米粒的腦靶向性;(2)所采用的基因載體PAMAM是近年來發(fā)展起來的新型陽離子高分子材料,易于修飾,載基因能力較高。
　　 本文第一章首先進行高分子材料的篩選,比較了殼聚糖(CH)、聚乙烯亞胺(PEI)和不同代數PAMAM的基因包載效率、不同納米粒體外轉染原代培養(yǎng)腦毛細血管內皮細胞(BCECs)的效率等性質。瓊脂糖凝膠電泳和DNA含量測定(PicoG

4、reen分析)結果顯示,各載體高分子與DNA的質量比達到一定值時,各載體高分子可完全包封DNA,復合形成的納米粒均有一定抵抗外界陰離子物質的置換作用,能保護所包載DNA免受DNase的降解并保持DNA的完整性。熒光顯微鏡和熒光素酶定量分析結果顯示,第5代PAMAM(PAMAMG5)/DNA納米粒的表達效率較高。綜合文獻報道,PAMAMG5可較好平衡基因轉染效率、細胞毒性等各方面因素,本課題最終采用PAMAMG5為高分子載體。
　　

5、 選定了基礎載體高分子后,本文第二章先采用經典腦靶向頭基轉鐵蛋白(Tf)通過PEG修飾PAMAM,構建了PAMAM-PEG-Tf.UV-vis、1H-NMR和SDS-PAGE結果顯示載體高分子PAMAM-PEG-Tf合成成功。熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞內攝取納米粒的結果表明,PAMAM-PEG-Tf的細胞攝取效率在較低濃度范圍內呈濃度依賴性,在高濃度時有飽和趨勢。并且,125I放射性標記PAMAM后各載體高分子的體內分布結果顯示,

6、經Tf修飾后的載體高分子在腦組織的分布量約為單純PAMAM的2.25倍。制備的PAMAM-PEG-Tf/DNA納米粒,其粒徑在200nm左右,zeta電位在13mV左右,電鏡觀察顯示納米粒呈球形,表面圓整光滑,具有良好的穩(wěn)定性。經Tf修飾后,納米粒在BCECs和腦內的表達均顯著高于未修飾的納米粒。但是,Tf作為腦靶向頭基存在一定局限性,如Tf受體介導的雙向跨BBB轉運功能可能降低通過Tf受體介導入腦的納米粒在腦內的濃集量、生理狀態(tài)下。B

7、BB上大部分Tf受體可能被內源性Tf占據而降低納米粒腦靶向性等,需要尋找新的高效的腦靶向頭基用于基因遞釋系統的構建,提高載基因納米粒的腦靶向性和腦內基因表達效率。
　　 根據文獻報道,Lf具有優(yōu)于Tf和抗Tf受體單克隆抗體OX26的腦內轉運效率,提示Lf有可能成為更好的腦靶向頭基。但目前關于腦部Lf受體的表征主要是在體外BBB模型上,尚無關于腦組織Lf受體表征的報道,本文第三章對原代培養(yǎng)BCECs和小鼠腦組織上的Lf受體進行表征

8、。共聚焦顯微鏡和結合動力學實驗結果顯示,Lf與其受體的結合具有飽和性和競爭抑制現象。結合飽和實驗結果顯示,腦部Lf受體存在高低兩個結合位點,低濃度時主要和高結合位點結合,高濃度時才進一步與低結合位點結合。Lf與BCECs表面高低結合位點的Kd值分別為6.77nM和4815nM;與腦細胞膜上高低結合位點的Kd值分別為10.61nM和2228nM。
　　 綜合第三章研究結果和相關文獻可見,Lf作為腦靶向頭基具有多項優(yōu)勢,包括:Lf受

9、體介導的跨BBB單向轉運功能更利于Lf修飾的納米基因遞釋系統在腦組織濃集、生理狀態(tài)下血循環(huán)中Lf的低濃度使內源性Lf不會大量占據腦細胞膜上Lf相關受體等。本文第四章首次采用Lf為腦靶向頭基,考察Lf修飾的載體高分子PAMAM-PEG-Lf及其載基因納米粒的體內外性質。熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測結果顯示,PAMAM-PEG-Lf的細胞攝取效率在一定范圍內呈濃度依賴性,在高濃度時有飽和趨勢。并且,在相同濃度比較時,PAMAM-PEG-Lf的

10、細胞攝取和腦內分布高于PAMAM-PEG-Tf,而其他組織的分布量顯著下降。在此基礎上制備了PAMAM-PEG-Lf/DNA納米粒,其粒徑在210nm左右,zeta電位在25mV左右,電鏡觀察顯示納米粒呈球形,表面圓整光滑,同時透射電鏡下觀察到納米粒表面的膠體金顆粒,證實了納米粒表面存在數十個Lf分子。與Tf修飾的納米粒比較,經Lf修飾后的納米粒在BCECs和小鼠腦內的表達均顯著提高。納米粒體內基因表達分布結果顯示,PAMAM-PEG-

11、Lf/DNA納米粒的腦內基因表達量約為PAMAM-PEG-Tf/DNA納米粒的2.3倍,而全身其他器官的基因表達降低,顯示了Lf作為腦靶向頭基的優(yōu)越性。
　　 由于Lf首次作為腦靶向頭基、載體高分子PAMAM-PEG-Lf為本課題首次合成,國內外未見報道,該載體高分子及其載基因納米粒的入腦機制尚不清楚,本文第五章對此進行了探討。細胞攝取抑制實驗結果表明,PAMAM-PEG-Lf保留了PAMAM的高分子特性和Lf的配體-受體結合性

12、質,可以經多種途徑包括網格蛋白有被小窩和細胞膜穴樣內陷依賴性內吞途徑以及巨胞飲途徑被原代培養(yǎng)BCECs攝取;PAMAM-PEG-Lf載體高分子及其載基因納米粒主要通過受體介導的穿細胞轉運過程跨越BBB,但仍保留了吸附介導的轉運機制。另外,經葉綠素銅腦內示蹤實驗證實PAMAM-PEG-Lf/DNA納米?？煽缭紹BB進入腦組織。
　　 最后,因文獻報道帕金森病(PD)患者腦部神經元和微血管上Lf受體表達顯著增加,本文第六章以PD為疾

13、病模型,評價了PAMAM-PEG-Lf包載編碼人源性膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)的治療基因(hGDNF)的納米粒在急性、慢性PD模型大鼠上的藥效,設計了多次給藥方案,并比較了單次、多次靜脈給藥后的治療效果,未見文獻報道。結果表明,單次給藥時,PAMAM-PEG-Lf/hGDNF納米粒的腦部基因表達最高,且隨時間會降低;多次給藥可以持續(xù)增加納米粒的腦內基因表達,5次給藥的表達量顯著高于單次給藥或3次給藥,證實了多次給藥的可行性和有

14、效性。同時,在6-OHDA單側損毀急性模型上,多次給藥組能顯著改善阿樸嗎啡誘導的PD癥狀,明顯增加紋狀體和黑質中多巴胺能神經元的數目,同時還提高了損毀側多巴胺(DA)及其代謝產物的量,接近未損毀側的水平,顯示出其優(yōu)越性。在魚藤酮慢性模型上,多次給予PAMAM-PEG-Lf/hGDNF納米粒同樣顯示出優(yōu)于單次給藥的療效,多次給藥能顯著改善PD大鼠的行動能力,提高酪氨酸羥化酶(TH)免疫反應性,同時提高紋狀體中DA及其代謝產物的水平。以上實