多肽介導肝腫瘤靶向診斷與治療的納米載藥系統(tǒng).pdf

1、目前惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升，肝腫瘤是我國常見惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤發(fā)病順序中占第二位，每年新增病例超過30萬。肝腫瘤具有惡性度高、病情發(fā)展快、生存期短等特點。肝腫瘤死亡率很高，平均5年生存期患者的比例僅為14.4％。肝腫瘤的診斷和治療存在很多尚未解決的問題。早期肝腫瘤缺乏明顯的癥狀，采用目前臨床上常用造影劑，由于缺乏對腫瘤的特異性識別，很難在早期發(fā)現(xiàn)肝腫瘤。目前仍然只有早期小型肝腫瘤可手術切除治療，晚期肝腫瘤手術困難且術后高復發(fā)。藥

2、物是肝腫瘤治療中的重要手段，然而目前的抗腫瘤藥物腫瘤靶向性差、治療效果不佳、毒副作用大。迄今為止尚缺乏有效的治療藥物。
　　 靶向納米藥物技術在腫瘤的診斷和治療中顯示出獨特的優(yōu)勢和良好的臨床應用前景。本文的目的是通過構建多肽介導肝腫瘤靶向診斷與治療的納米載藥系統(tǒng)來解決上述肝腫瘤診斷與治療中存在的問題。
　　 肝腫瘤細胞活動旺盛、迅速分裂生長，因而形成了腫瘤組織、細胞不同于正常組織、細胞的病理變化：新生血管結構不完整，腫瘤

3、血管滲透滯留增強(enhanced permeability and retention effect，EPR)[1-5]、無氧代謝、細胞轉化、生長失控和跨膜pH調節(jié)能力增加形成的腫瘤細胞外弱酸環(huán)境[6-10]、營養(yǎng)物質大量需求形成的腫瘤細胞表面相關受體的表達上調[11-20]。這些與正常組織不同的病理特征，為靶向納米遞藥系統(tǒng)的設計、應用提供了依據(jù)。
　　 本文針對肝腫瘤病理特征，(1)腫瘤血管滲透滯留增強，(2)腫瘤細胞外弱酸

4、環(huán)境；(3)表達上調受體，設計三種肝腫瘤靶向遞送的策略，并依次三種策略將全文分為三個部分共七章內(nèi)容：
　　 第一部分結合EPR效應和腫瘤細胞外微酸環(huán)境的策略一
　　 基于EPR效應被動靶向的設計主要是將藥物遞送系統(tǒng)設計在納米尺度，經(jīng)血液循環(huán)被動靶向進入腫瘤組織，實現(xiàn)組織水平腫瘤靶向。
　　 而本文第一部分策略一是在納米遞送系統(tǒng)經(jīng)EPR效應被動靶向進入腫瘤組織后，結合腫瘤細胞外微酸環(huán)境，實現(xiàn)從腫瘤組織向腫瘤細胞的靶

5、向。而基于腫瘤細胞外微酸環(huán)境從腫瘤組織向腫瘤細胞的靶向則是來源于一種可在弱酸性條件下插入到細胞膜的多肽。
　　 pH敏感肽pH-Low-Insertion-Peptide(pHLIP)來源于細菌視紫紅質的跨膜螺旋蛋白C，在弱酸性條件下(pH6-6.5)可插入細胞膜形成跨膜螺旋[21-24]。通過親水性高分子聚乙二醇：Polyethylene glycol(PEG)利用pHLIP修飾樹枝狀高分子聚賴氨酸Dendrigraft Po

6、ly-L-lysines(DGL)，合成腫瘤細胞靶向載體DGL-PEG-pHLIP。利用DGL-PEG-pHLIP攜載藥物設計納米載藥系統(tǒng)可通過EPR效應和腫瘤細胞外微酸環(huán)境下pHLIP的插入細胞膜作用實現(xiàn)腫瘤組織到腫瘤細胞的兩步靶向。本文第一章利用DGL-PEG-pHLIP攜載pH敏感熒光探針(BF2-chelated tetraarylazadipyrromethenes)，制備pH敏感熒光探針納米載藥系統(tǒng)。本文全新合成的pHLIP

7、修飾腫瘤細胞膜靶向pH敏感熒光探針納米載藥系統(tǒng)分別基于pH智能控制的電子轉移和酚羥基/酚鹽轉變兩種機理發(fā)射熒光，在正常組織中性pH下電子的共軛轉移無熒光，酸性條件下分子內(nèi)電子的共軛體系破壞從而開啟分子的近紅外熒光。pH敏感熒光探針熒光強度隨pH降低增強，pH6.0時熒光強度是pH7.4時的8倍。此外，該納米載藥系統(tǒng)具有水溶性和肝腫瘤細胞膜靶向性。本文第二章利用DGL-PEG-pHLIP制備了肝腫瘤靶向載基因納米載藥系統(tǒng)(Nanopart

8、icles，NP)。血管內(nèi)皮細胞生長因子Vascular Endothelial GrowthFactor(VEGF)是促進腫瘤新生血管形成的重要因子[25]。小分子RNA干擾技術下調VEGF可有效抑制腫瘤新生血管形成[26，27]。DGL-PEG-pHLIP復合VEGF沉默質粒(small hairpin RNA against VEGF，shVEGF)制備了肝腫瘤靶向載基因納米載藥系統(tǒng)pHLIP-NP/shVEGF。pHLIP-NP

9、/shVEGF具有良好的腫瘤靶向效率，肝腫瘤部位的濃集效率是未修飾納米載藥系統(tǒng)NP/shVEGF的4倍，具有高效的VEGF沉默效果，能夠有效抑制肝腫瘤新生血管的生成，從而顯著抑制腫瘤生長。
　　 第二部分結合EPR效應和腫瘤細胞高表達受體介導的主動靶向的策略二
　　 如策略一所述，EPR效應被動僅能實現(xiàn)組織水平腫瘤靶向，除了腫瘤細胞外微酸環(huán)境，腫瘤細胞表面過度表達的受體可被用來作為靶點，通過在納米系統(tǒng)上修飾可以特異性結合

10、這些受體的配體，可實現(xiàn)從腫瘤組織向腫瘤細胞的靶向。而這需要受體的選擇和靶向頭基的引用。
　　 轉鐵蛋白(transferrin，Tf)受體(transferrin receptor，TfR)在肝腫瘤細胞表面表現(xiàn)為高表達[12，28]。目前，Tf被作為腫瘤靶向頭基廣泛應用于腫瘤靶向納米載藥系統(tǒng)的設計。但是內(nèi)源性高濃度Tf可能影響Tf修飾納米載藥系統(tǒng)的腫瘤靶向效率；而且Tf本身分子量大(80 kDa)，其化學修飾存在一定的難度。本文

11、第三章基于Tf作為靶向頭基介導腫瘤靶向遞送存在的局限性，考察通過噬菌體展示技術篩選出可特異性結合人TfR并內(nèi)吞入胞的分別含7和12個氨基酸的T7肽(HAIYPRH)和T12肽(THRPPMWSPVWP)作為靶向頭基的可能性[29]。
　　 評價樹枝狀高分子(polyamidoamine dendrimers，PAMAM)通過PEG修飾上述潛在靶向頭基制備的載體(PAMAM-PEG-T7、PAMAM-PEG-T12、PAMAM-P

12、EG-Tf)在高表達TfR腫瘤細胞上的攝取。在血漿高濃度Tf存在時PAMAM-PEG-Tf的攝取相比無Tf存在時明顯降低；而PAMAM-PEG-T7與無內(nèi)源性Tf存在時攝取更加顯著，這證明了TfR上與T7的結合位點和與Tf的結合位點不同[30]。T7有可能解決Tf作為靶向頭基介導腫瘤靶向遞送存在的局限性。本文基于策略二的部分選用T7作為腫瘤靶向頭基。
　　 本文第四章以PAMAM-PEG-T7共價連接二乙基三胺五乙酸(Dieth

13、ylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)，螯合Gd3+，形成肝腫瘤靶向磁共振造影劑納米載藥系統(tǒng)GdDTPA-PAMAM-PEG-T7。PAMAM-PEG-T7在肝腫瘤細胞上的攝取顯著高于PAMAM-PEG。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7的弛豫率是市售釓噴酸葡胺(GdDTPA)的2.2倍。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7對裸鼠皮下肝腫瘤增強效果是GdDTPA-PAMAM-PEG的2.9倍，GdD

14、TPA的4.1倍。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7能夠高效特異性靶向肝腫瘤、并延長顯像時間。
　　 PAMAM內(nèi)部含有大量疏水空腔，可包載疏水性藥物[31-35]。本文第五章以PAMAM-PEG-T7包載疏水性抗腫瘤藥物阿霉素(Doxombicm，DOX)，形成肝腫瘤靶向DOX納米載藥系統(tǒng)PAMAM-PEG-T7/DOX。PAMAM-PEG-T7/DOX粒徑大約在10 nm?；赑AMAM的空間構象隨著pH從中性至酸性呈現(xiàn)

15、敏感變化[36]，PAMAM-PEG-T7/DOX中DOX在微酸環(huán)境中快速釋放，而在中性條件下基本穩(wěn)定。PAMAM-PEG-T7/DOX顯著增加了肝腫瘤細胞對DOX的攝取。內(nèi)源性Tf的存在顯著降低PAMAM-PEG-T7/DOX對肝腫瘤細胞的IC50。PAMAM-PEG-T7/DOX在皮下肝腫瘤部位的濃集效率是PAMAM-PEG/DOX的1.7倍，游離DOX的5.3倍，顯示出良好的腫瘤生長抑制效果。
　　 利用DOX可插入到基因

16、雙鏈中形成穩(wěn)定復合物的特性[37，38]，本文嘗試了基因藥物和DOX的聯(lián)合給藥。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)是介導細胞凋亡的信號分子，能夠特異性與腫瘤細胞表面受體結合誘導凋亡，但不殺傷正常細胞[39，40]；同時DOX可顯著提高TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的效率[4]。本文第六章采用TRAIL蛋白編碼質粒(anexpression vector co

17、ntaining TRAIL open reading frame，pORF-hTRAIL)作為基因藥物，將DOX插入到pORF-hTRAIL，形成pORF-hTRAIL-DOX復合物，以PAMAM-PEG-T7通過靜電作用復合pORF-hTRAIL-DOX復合物，形成肝腫瘤靶向載TRAIL基因DOX納米載藥系統(tǒng)PAMAM-PEG-T7/pORF-hTRAIL-DOX，多靶點不同機制聯(lián)合治療肝腫瘤。每個pORF-hTRAIL分子可以攜載

18、約375個DOX分子。PAMAM-PEG-T7/pORF-hTRAIL-DOX相比未修飾組在肝腫瘤細胞上的攝取、基因藥物表達和誘導細胞凋亡效果更為顯著。同時，DOX的給藥劑量降低約30倍，可達到比臨床劑量DOX更好的腫瘤生長抑制效率。
　　 第三部分結合EPR效應、腫瘤細胞外微酸環(huán)境和主動靶向的策略三
　　 TfR不僅在腫瘤細胞表面高度表達[42-44]，在正常組織細胞如肝細胞、脾細胞、肺細胞、腎細胞等的表面都有表達，甚

19、至在腦細胞表面也有表達[45]。因此，在利用T7介導增加藥物腫瘤細胞靶向濃集的同時，可能導致正常細胞的藥物蓄積，引發(fā)不必要的毒副作用。綜合考慮腫瘤組織和正常組織的病理、生理差異，本文第七章設計了基于EPR效應、腫瘤細胞外微酸環(huán)境響應和主動靶向相結合的，腫瘤細胞外微酸環(huán)境控制開啟的主動靶向納米載藥系統(tǒng)。采用親水、負電的DTPA分子通過腙鍵改裝T7肽末端，合成DTPA改裝載體(DGt-PEG-T7-hydrazone-DTPA，DPThD)

20、。在正常組織，T7肽被DTPA所隱蔽，不能被TfR識別、結合并介導入胞。而在腫瘤組織，腫瘤微酸環(huán)境下腙鍵斷裂水解，T7肽顯露出來并特異性識別結合。YfR介導入胞。此外，DTPA的親水性，還可以大大降低補體系統(tǒng)的識別，延長納米載藥系統(tǒng)在血液中的循環(huán)時間。鈣粘蛋白(Cadherin17，CDH17)與肝腫瘤轉移息息相關[46]。CDH17沉默質粒(small hairpin RNA against CDH17，shCDH17)作為基因藥物，