基于碳納米管的納米載藥體系的構(gòu)建及其腫瘤靶向性評(píng)價(jià).pdf

1、納米尺度的藥物傳遞體系可借助腫瘤組織特有的高滲透長(zhǎng)滯留(EPR)效應(yīng)在腫瘤部位有效靶向富集，為人們解決傳統(tǒng)藥物治療中遇到的難題提供了新的解決方案。單臂碳納米管(SWCNTs)具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力，稍加修飾即可攜帶多種有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、化療藥物等）進(jìn)入細(xì)胞，構(gòu)建基于SWCNTs的納米載體用于腫瘤的靶向治療具有廣泛前景。
　　由于腫瘤的不均勻性，腫瘤內(nèi)部的EPR效應(yīng)很不明顯，致使納米載藥體系的療效受限?？赏ㄟ^(guò)局部熱療

2、法改變腫瘤內(nèi)部的血管通透性，提高藥物的腫瘤內(nèi)部滲透能力。生物系統(tǒng)對(duì)700-1000nm范圍的近紅外光(NIR)具有高通透性，SWCNTs對(duì)此范圍的NIR有高吸收特性，可以將NIR的光能轉(zhuǎn)換為熱能，實(shí)現(xiàn)腫瘤的熱療的同時(shí)也可以提高納米載藥體系在腫瘤部位的滲透效果。因此，我們通過(guò)在SWCNTs表面修飾殼聚糖以提高其生物相容性，構(gòu)建了對(duì)溫度和NIR響應(yīng)的納米載藥體系(NPS)，搭載化療藥物阿霉素DOX制成NPS-DOX，并對(duì)其腫瘤靶向性進(jìn)行評(píng)價(jià)

3、。
　　納米載藥體系傳遞藥物的另一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程是如何快速的被腫瘤細(xì)胞攝取，使藥物能夠到達(dá)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)達(dá)到治療目的。為提高NPS的進(jìn)細(xì)胞效率，我們構(gòu)建了表面修飾細(xì)胞穿膜肽(TAT)的納米顆粒(NPS-TAT)和模擬細(xì)胞穿膜肽功能的胍基化納米顆粒(G-NPS)，以增強(qiáng)納米載藥體系的腫瘤靶向性能。
　　目的:
　　制備具備溫度和NIR響應(yīng)特性的納米載藥體系NPS，并對(duì)其腫瘤靶向性進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究經(jīng)胍基化修飾的NPS的腫瘤細(xì)胞靶向

4、性輸送的行為，重點(diǎn)是細(xì)胞胞吞途徑、效率、細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器定位等關(guān)鍵問(wèn)題。
　　方法:
　　1.近紅外光介導(dǎo)下尺寸可控的納米載體(NPS)用于增強(qiáng)藥物腫瘤靶向輸送的研究:
　　a.制備:酸化超聲方法重切分散SWCNTs;殼聚糖修飾SWCNTs制成CS-OA@SWCNTs納米顆粒;聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)在其表面交聯(lián)溫敏性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)，制成溫度、NIR雙重敏感的NPS;
　　b.

5、表征:動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、透射電鏡(TEM)等手段對(duì)制備的納米顆粒進(jìn)行表征，包括粒徑大小、表面電勢(shì)、表面形貌等;
　　c.特性研究:離心分離法研究載藥納米顆粒在不同溫度及pH下的釋藥特性;細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒研究納米顆粒響應(yīng)NIR對(duì)細(xì)胞的損傷情況;CCK-8試劑盒研究NPS對(duì)MB49細(xì)胞的毒性作用;
　　d.腫瘤靶向性評(píng)價(jià):激光共聚焦顯微鏡觀察NPS的進(jìn)細(xì)胞途徑及其胞內(nèi)分布情況;免疫組化及免疫熒光評(píng)價(jià)其在NIR介導(dǎo)

6、下的腫瘤靶向性。
　　2.具有細(xì)胞穿膜功能的刺激響應(yīng)性納米載體的制備及其增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物輸送研究:
　　1)G-NPS的制備及腫瘤靶向性評(píng)價(jià)
　　a.制備:1H-吡唑-1-甲脒鹽酸鹽將NPS中殼聚糖的伯氨基胍基化，制成胍基化納米顆粒G-NPS。
　　b.表征:DLS對(duì)納米顆粒的粒徑大小、表面電勢(shì)進(jìn)行表征。
　　c.特性研究:DLS研究G-NPS對(duì)溫度的響應(yīng)特性，并與NPS進(jìn)行比較;CCK-8試劑盒檢測(cè)G-

7、NPS對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性作用。
　　d.腫瘤靶向性評(píng)價(jià):激光共聚焦顯微鏡觀察G-NPS的進(jìn)細(xì)胞途徑。
　　2)NPS-TAT的制備及表征:
　　a.制備:6-（馬來(lái)酰亞胺基）己酸琥珀酰亞胺酯(GMBS)作連接劑連接NPS與細(xì)胞穿膜肽，制成NPS-TAT。
　　b.表征:DLS對(duì)納米顆粒的粒徑大小、表面電勢(shì)進(jìn)行表征。
　　結(jié)果:
　　1.DLS及TEM結(jié)果表明制得的NPS粒徑約200 nm，大致呈球

8、形。離心分離法檢測(cè)NPS-DOX的釋藥特性發(fā)現(xiàn)，藥物在溫度升高、pH降低時(shí)其DOX釋放率有明顯增加，表明NPS具有良好的溫度響應(yīng)性，且在酸性條件下更易釋藥的特性。CCK-8細(xì)胞毒性結(jié)果表明，NPS本身表現(xiàn)出低毒性，載藥后表現(xiàn)出長(zhǎng)效的殺傷細(xì)胞作用，并且可以有效響應(yīng)NIR，其殺傷作用明顯增強(qiáng)。激光共聚焦結(jié)果顯示，納米顆粒主要通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，均勻分散在細(xì)胞質(zhì)中，后進(jìn)入溶酶體，釋放藥物，且NIR可提高其進(jìn)細(xì)胞效率。結(jié)果還表明納米顆?？梢栽?/p>

9、線粒體中富集，這與SWCNTs的線粒體靶向特性有關(guān)。免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示，NPS可在腫瘤部位有效富集，且NIR可促進(jìn)其靶向作用。
　　2.經(jīng)胍基化得到的G-NPS較NPS粒徑略有增大，表面電勢(shì)增大明顯。G-NPS與NPS的溫度響應(yīng)結(jié)果一致，說(shuō)明胍基化并未對(duì)納米顆粒的溫度響應(yīng)特性造成影響。胍基化后納米顆粒毒性不變，但可以提高載藥納米顆粒的殺傷細(xì)胞作用，且不影響其NIR響應(yīng)特性。激光共聚焦結(jié)果顯示G-NPS較NPS其進(jìn)細(xì)胞效率明