水溶性單壁碳納米管腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建和熱療研究.pdf

1、單壁碳納米管(SWNTs)是一種特殊的納米材料,具有許多獨(dú)特的物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)特性,自被發(fā)現(xiàn)之日起,它就引起了人們廣泛的關(guān)注。近年來(lái),SWNTs的應(yīng)用跨越了多個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域,人們一直致力于研究SWNTs潛在的生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的應(yīng)用。但是SWNTs具有高度疏水的表面,不溶于水以及常見(jiàn)的有機(jī)溶劑,生物相容性差嚴(yán)重限制了其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。因此,改善SWNTs的生物相容性是解決SWNTs生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的首要問(wèn)題。
　　 由于SWNTs具

2、有較強(qiáng)的跨細(xì)胞膜能力,因此適當(dāng)功能化的SWNTs能夠攜帶多種有機(jī)或無(wú)機(jī)粒子(其中包括蛋白質(zhì)、核酸和化學(xué)藥物等活性分子)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并且不表現(xiàn)出毒性。傳統(tǒng)物理功能化的方法,可以使碳納米管達(dá)到分散的目的,但是物理功能化的方法經(jīng)常伴隨著表面活性劑毒性高、在體內(nèi)容易解聚等缺點(diǎn),在實(shí)際應(yīng)用中十分有限。因此,構(gòu)建具有腫瘤靶向性的化學(xué)功能化碳納米管具有科學(xué)意義和廣泛的應(yīng)用前景。
　　 生物系統(tǒng)對(duì)700～1,100nm范圍的近紅外光具有高度透過(guò)

3、性,而SWNTs在此范圍內(nèi)具有高吸收的特性,可以利用SWNTs在此范圍內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換特性對(duì)腫瘤進(jìn)行激光熱療。將SWNTs腫瘤靶向給藥系統(tǒng)和激光熱療聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到更加有效的抗腫瘤作用。
　　 本論文主要構(gòu)建了聚乙烯亞胺(PEI)共價(jià)功能化的SWNTs腫瘤靶向給藥系統(tǒng),并且研究了該給藥系統(tǒng)在裸鼠體內(nèi)和體外的抗腫瘤活性作用及其聯(lián)合熱療的抗腫瘤活性作用,其主要內(nèi)容如下:
　　 1.SWNT-PEI的合成及表征。通過(guò)純化、氧化、氨

4、基化和PEI聚合化等步驟對(duì)SWNTs進(jìn)行化學(xué)功能化。使用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、核磁共振(NMR)、透射電鏡(TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、熱重分析(TGA)、粒度分析(PSD)等儀器對(duì)所合成的SWNTs樣品進(jìn)行表征。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)一系列的化學(xué)功能化,在SWNTs表面有聚合化的PEI形成,并且SWNTs本身的結(jié)構(gòu)基本無(wú)變化,具有良好的粒徑分布,能夠在數(shù)星期甚至數(shù)月中保持穩(wěn)定。
　　 2.SWNT-PEI/siRNA

5、/NGR腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建。在SWNT-PEI中加入一定量的二硬脂酸磷脂酰胺一聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺(DSPE-PEG2000-Maleimide),通過(guò)π-π堆積連接在SWNTs上,利用其尾端的馬來(lái)酰亞胺通過(guò)巰基連接含有NGR基序(天冬酰胺一甘氨酸一精氨酸,Asn-Gly-Arg)的多肽序列,使SWNTs載體系統(tǒng)具有腫瘤血管靶向性。通過(guò)靜電相互作用,使帶負(fù)電的hTERT siRNA與SWNT-PEI載體結(jié)合形成腫瘤治療靶向給

6、藥系統(tǒng)。使用紫外全波長(zhǎng)掃描和瓊脂糖凝膠電泳(AGE)確定SWNTs載體系統(tǒng)荷載siRNA的情況;利用熒光分光光度法檢測(cè)NGR靶頭的連接情況;考察靶向給藥系統(tǒng)的載藥性能和穩(wěn)定性。結(jié)果表明,SWNT-PEI/siRNA/NGR腫瘤靶向給藥系統(tǒng)荷載siRNA完全,成功連接了NGR多肽靶向基團(tuán)。結(jié)果表明,SWNT-PEI/siRNA/NGR腫瘤靶向給藥系統(tǒng)具有較好的穩(wěn)定性和生物相容性。
　　 3.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR

7、腫瘤靶向給藥系統(tǒng)對(duì)PC-3人前列腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。使用苯磺羅丹明B(SRB)法考察空白載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用及靶向給藥系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞存活率的影響;使用熒光顯微鏡考察不同時(shí)間內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)載體系統(tǒng)的攝取情況;通過(guò)流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞的凋亡情況;通過(guò)RT-PCR和Western Blotting分析細(xì)胞內(nèi)hTERT mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明,SWNT-PEI空白載體在劑量范圍內(nèi)對(duì)PC-3人前列腺癌細(xì)胞毒性很小;SWNT-PE

8、I/siRNA/NGR腫瘤靶向載體系統(tǒng)能夠在4h內(nèi)被細(xì)胞攝取完全,且轉(zhuǎn)染率約為單純PEI的兩倍;釋放的siRNA能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)hTERTmRNA和蛋白的表達(dá),并且使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。
　　 4.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR腫瘤靶向給藥系統(tǒng)對(duì)裸鼠主要器官的毒性作用、體內(nèi)分布及對(duì)PC-3荷瘤裸鼠腫瘤的抑瘤效果。以PC-3荷瘤裸鼠為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)裸鼠心、肝、脾、肺和腎組織的HE染色切片分析,證明了靶向給藥系統(tǒng)對(duì)裸鼠主要臟

9、器在劑量范圍內(nèi)沒(méi)有明顯毒性;利用量子點(diǎn)(QDs)對(duì)SWNTs載體系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記,考察了SWNTs載體在裸鼠體內(nèi)的生物分布情況;通過(guò)定期測(cè)量荷瘤裸鼠腫瘤體積繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,證明了SWNT-PEI/siRNA/NGR對(duì)腫瘤有明顯抑制作用;體內(nèi)腫瘤RT-PCR、Western和凋亡檢測(cè)結(jié)果表明,載體系統(tǒng)可以有效抑制hTERT mRNA、蛋白的表達(dá),并且能夠促使細(xì)胞凋亡。
　　 5.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR腫瘤靶向載體系

10、統(tǒng)聯(lián)合熱療的抗腫瘤效果,對(duì)808nm近紅外激光熱療效果進(jìn)行了體內(nèi)和體外的評(píng)價(jià)。808nm激光熱療體外結(jié)果顯示,SWNT-PEI/siRNA/NGR腫瘤靶向載體系統(tǒng)的發(fā)熱效率具有SWNTs濃度依賴性和時(shí)間依賴性;SWNT-PEI/siRNA/NGR聯(lián)合熱療組與各對(duì)照組相比,對(duì)PC-3腫瘤細(xì)胞的增值有明顯的抑制作用;通過(guò)對(duì)裸鼠腫瘤體積的考察,熱療組治療效果明顯優(yōu)于單純載體系統(tǒng)組。
　　 通過(guò)本論文中的方法構(gòu)建的SWNT-PEI/si